携载rhBMP
作者：费正奇，胡蕴玉，吴道澄，吴红，白建萍，蒲勤
【关键词】 携载
摘 要：［目的］制备一种具有良好降解性和成骨活性、可注射的自凝固新型骨修复材料。［方法］制备携载rhBMP2的聚乳酸与聚乙醇酸共聚物(PLGA)微球，并将其与 rhBMP2／磷酸钙骨水泥(CPC)复合，制备出rhBMP2／PLGA微球／CPC复合人工骨。探讨了材料的特性，包括形貌、固化时间、抗压强度及反映材料体外降解速度的指标―体外降解液Ca、P浓度变化，测定复合材料rhBMP2的释药速度及体外诱导MSCs细胞成骨分化的能力。［结果］与单纯CPCrhBMP2相比，复合材料的固化时间少量增加，抗压强度下降明显。体外降解速度及体外释药明显提高，释放的rhBMP2具有骨诱导活性。［结论］rhBMP2／PLGA微球／磷酸钙骨水泥新型复合人工骨是具有良好应用前景的骨修复材料。
关键词：聚乳酸与聚乙醇酸共聚物； 微球； 磷酸钙骨水泥； 重组人骨形态蛋白2； 骨替代物
Abstract：［Objective］To develop a novel injectable in situ settting bone graft substitute with higher degradation rate, more release of rhBMP2/CPC.［Method］rhBMP2 loaded PLGA micropheres, fabricated by using a doubleemulsion, solventextraction ［(waterinoil) inwater］ technique, was incorporated in rhBMP2/CPC during setting. The processing parameters and fundamental properties included microstructure, setting time, compressive strength, and the in vitro degradation of the composite which was indicated by concentration of Ca and P in the degradation liquid were investigated. Meanwhile, as a delivery system of rhBMP2, the release kinetics and the bioactivity of the released rhBMP2 for the composite were determined in vitro. ［Result］The diameter of PLGA microsphere was 253μm±64μm, load density of rhBMP2 was 0.52%±0.14%. Compared with that of rhBMP2/CPC, the setting time increased slightly,the compressive strength decreased significantly,but still stronger than that of the composite when microspheres dissolved. The concentrations of Ca and P in the degradation liquid of composites were higher than that of rhBMP2/CPC at all time points. All implants showed a sustaining release for 28 days, the composite released a greater amount of rhBMP2 than CPC delivery system. Alkaline phosphatase (ALP) ,one of the markers of the osteoblast phenotype, was dramatically stimulated by rhBMP2.［Conclusion］ The in vitro degradation and rhBMP2 release can be upgraded by intermixing of the biodegradable rhBMP2 loaded PLGA microspheres with CPC during setting, therefore, the combination of rhBMP2 loaded PLGA microspheres and CPC forms a promising synthetic bone graft.
Key words: Poly(lacticcoglycolic acid)(PLGA); Calcium phosphate cement (CPC); Recombinant human bone morphogenetic protein2(rhBMP2); Microsphere; Bone substitute
磷酸钙骨水泥(calcium phosphate cement，CPC)是一种或几种磷酸盐的粉未加上稀酸或生理盐水混和而成的一种新型自固化型人工骨替代材料，其固化后终产物为化学成分及晶相结构与骨组织无机成分相似、可被逐渐降解吸收的羟基磷灰石(HA)，因而其具有良好的生物相容性、骨传导性和可降解性。与钙磷陶瓷骨修复材料相比，CPC的优点在于其可注射、塑形容易、聚合时不放热、可降解，同时可作为生物活性因子的良好载体，具有良好的临床应用前景［1，2］。但临床应用中发现CPC存在以下问题需改进［2］∶(１)CPC孔径较小，孔隙率较低，不利于新骨的长入，CPC微孔直径约2～20μm，孔隙度约40％；(2)降解缓慢不利于骨快速愈合；(3)不具备骨诱导能力；(4)作为BMP载体时BMP释放缓慢。为此我们制备rhBMP2／PLGA载药微球与CPC复合，以提高材料的降解性和释药速度，制备较理想的可注射、自凝固骨修复材料。
1 材料与方法
11 主要试剂与仪器
PLGA(PLA／PGA；50／50重均分子量：20000)由院成都有机所合成，重组人骨形态蛋白2(rhBMP2)由第四军医大学生化教研室提供， rhBMP2 ELISA检测试剂盒购自武汉博士德公司，CPC购自上海瑞邦公司，聚乙烯醇(PVA)购自Sigma公司。
12 实验方法
121 PLGABMP载药微粒制备
采用复乳-溶剂蒸发技术［3］制备PLGABMP载药微粒，主要步骤为：20％PLGA／二氯甲烷1ml加016％rhBMP2液100μl(含01％牛血清白蛋白)乳化1 min，加1 ml 1％PAV乳化1 min，再加1％PAV100 ml与05％异丙醇100 ml，以300r／min搅拌4 h，静置30 min，水洗4遍冷冻干燥，-20℃保存备用。光学显微镜、扫描显微镜观察微球的形态，采用Lica QWin分析软件测量微球的直径。微球载药率测定［4］：称取微球30 mg，将其置于1 ml NaOH(01 mol L-1)含SDS(50 g L-1液中，37℃平衡振摇24 h，取上清行rhBMP2 含量ELISA检测。
122 rhBMP2/CPC及rhBMP2/PLGA/CPC复合材料的制备
PLGA载药微球与CPC粉末分别以体积比0/100、50/50、60/40、70/30组成固相，液相为含rhBMP2的2％Na2HPＯ4液，固相粉末与液相常温下按3∶１(g ml-1)比例混和成糊状，注入直径5 mm、高5 mm的模具中，每个材料块含rhBMP2 250 μg，放入37℃、100％的湿度环境中，材料固化后脱模，制成柱形人工骨块于-20℃保存备用。
123 固化时间测定
采用Gillmore针法测定材料的固化时间［5］：材料浆注入模具后，每隔60 s将尖端直径1 mm、重400 g的锥形测试针小心地垂直降落到固化物表面停留5 s，直至表面不能观察到明显压痕。从开始混合搅拌至固化物表面无明显压痕的时间段为材料的固化时间。
124 抗压强度测试
脱模的试件37℃条件下，在PBS液中浸泡3 d后取出，用万能试验机(Autograph AGS10 KNG，日本岛津)测定材料的抗压强度。将测定后所得固化物断裂标本用于XRD分析及SEM检测。根据固化时间及抗压强度的测定结果，选用固相体积比为0／100、60／40作为rhBMP2／CPC、rhBMP2／PLGA／CPC试件进行以下实验。
125 X线衍射(XRD)分析
测定抗压强度所得固化物断裂标本低温冻干后用研钵研磨，所得粉末用X线衍射(XRD)仪(MAX2400，JEOL，日本)分析。
126 材料大体观察及扫描电镜(SEM)检测
将抗压强度测试后的断裂标本经干燥喷金，用扫描电镜(JSM5300．JEOL，日本)观察材料断面结构特点、孔径形态和BMP2颗粒分布。
127 复合材料体外降解及rhBMP2体外释放
分别将rhBMP2／CPC、rhBMP2／PLGA／CPC试件置于3 ml PBS(001 mol／L)释放介质中，释放介质是磷酸盐缓冲液(PBS，pH74)，含02g・L-1PVA和02 g・L-1叠氮钠。37℃平衡振摇，1、3、7、14、28 d取上清，-20℃保存并补充新鲜的释放介质，上清液rhBMP2 ELISA检测，同时测定释放液Ca、P浓度及pH值。取56 d时的复合材料进行SEM观察及抗压强度测定，观察材料的降解情况,测定PLGA微球降解后材料强度的变化。
128 释放rhBMP2体外成骨活性评价
1281 复合料rhBMP2体外释放液的制备
无菌条件下分别取环氧乙烷消毒的rhBMP2／CPC、rhBMP2／PLGA／CPC试件各4个浸入3 ml含10％胎牛血清的DMEM培养液中，置于含5％CO2、100％湿度、37℃条件下培养，分别于1、7 d收集24 h的释放液，于-20℃保存备用。
1282 rhBMP2体外释放液对兔MSCs细胞增殖的影响
所采用的细胞为第四军医大学西京骨科已建系的人MSCs细胞系(MSCxj)，将细胞按2×10３个/孔接种于96孔板，用含10％胎牛血清的DMEM培养液培养1 d后换液，分别加入200 μl不同时间组rhBMP2体外释放液，培养72 h后MTT法测细胞增殖情况。
1283 rhBMP2体外释放液对细胞分化的影响
用不同时间组rhBMP2体外释放液继续培养细胞至7 d，终止培养后弃去培养液，PBS漂洗3次，每孔加入100μl 2 ml・L-1 Triton X100，置入4℃条件24 h以裂解细胞，测定裂解液碱性磷酸酶(ALP)的含量。ALP试剂盒购自南京建成公司，具体操作按说明处理进行。
129 统计分析 所有数据采用非配对t检验经SPSS101进行统计分析。
2 实验结果
21 rhBMP2／PLGA微球的粒径形态及载药率
微球的球形度较好，均匀而圆整，流动性好，分布均匀。粒径范围较窄，85％微球直径在100～3500 μm之间，平均粒径为(253±64)μm，圆度系数为106。其扫描电镜照片见图1。微球的载药率为(052±014)％。
22 固化时间测定
不同体积比PLGA微球掺入后复合材料的固化时间变化结果见表1。从中可以看出，随PLGA微球量的增加，材料的固化时间呈增加趋势，但统计结果显示，各组之间差别不显著(P>005)。表1 PLGA掺入对CPC固化时间(分)的影响(略)
23 抗压强度测试结果
图2显示不同体积比复合材料抗压强度的变化。同样随PLGA微球量的增加，材料的抗压强度固化时间呈下降趋势，复合材料组的强度与单纯rhBMP2/CPC相比下降明显(P<001)，但明显高于60/40微球降解组(P<001)，各复合材料组间无明显差别(P>005)。
24 XRD分析
XRD分析结果见图3。将单纯rhBMP2/CPC与rhBMP2/PLGA/CPC复合材料的XRD比较可以看出，PLGA微球加入后，复合材料XRD图中除出现PLGA的衍射峰外无其它峰出现，同时各峰值高低并未改变。
25 扫描电镜(SEM)检测
图4显示新制备的rhBMP2/CPC及rhBMP2/PLGA/CPC断面的SEM结果。CPC中可见大量直径约1～10μm的微孔，孔隙率较低，在CPC/PLGA中微球均匀镶嵌于CPC中，且相互接触，微球与CPC固化所形成的基质HA结合紧密。图5为材料体外降解8周时的断面扫描电镜图。体外降解8周时单纯CPC组HA晶体形成明显，相互交连，CPCPLGA组微球已完全降解，形成大的微孔，直径在100 μm以上，且孔间有小的微孔相。
26 释放液Ca、P浓度及pH值
图6显示不同体外降解时期降解液中Ca浓度变化。P浓度变化与Ca显示相同的变化趋势。2周之前，单纯rhBMP2/CPC与复合材料Ca、P浓度无差别(P>005)，4周时复合材料Ca、P浓度明显升高(P<001)。图7为不同体外降解时期降解液pH值的变化，体外降解时单纯rhBMP2/CPC的pH值无明显变化(P>005)，PLGA微球组的pH值逐渐下降，复合材料的pH值变化介于两者之间。
27 材料rhBMP2体外释放测定
图8显示材料rhBMP2体外释放情况。各种材料24 h内浓度升高较快，随后释放量速度减慢，各个时间点复合材料rhBMP2浓度上升速度均高于单纯rhBMP2/CPC(P<005)，但明显低于rhBMP2/PLGA微球的释放速度(P<001)。
28 rhBMP2体外释放液对MSCs细胞增殖分化的影响
不同时间rhBMP2体外释放液对MSCs细胞增殖无明显影响(P>005)。rhBMP2体外释放液作用于MSCs细胞后细胞ALP测定结果见图9。不同时间点的释放液作用于细胞后，ALP活性均明显高于空白对照组(P<001)，7 d时复合材料组ALP活性高于单纯rhBMP2／CPC组(P<005)。
3 讨 论
本研究的目的是通过CPC粉末中掺入载有rhBMP2的PLGA微球制备出具有更好的降解性和成骨活性骨修复材料。设计思路在于PLGA微球掺入早期可维持材料的力学强度。由于PLGA微球的降解速度明显高于CPC，因而rhBMP2的释放速度提高，随PLGA微球的降解可在CPC中形成微孔，从而有利于CPC的降解和骨的长入。
本实验采用了复乳溶剂挥发法制备PLGA载药微球，与以前的单乳化法相比可以更好的提高微球的载药率，以避免极为珍贵的BMP在微球制备过程中的损失［6］。实验中通过调整微球制备的参数，使得大部分微球的粒径在100～300 μm之间，目前研究认为，粒径在100～300 μm孔径最适合骨的长入［3］，制备的 rhBMP2／PLGA载药微球经前期小鼠肌袋实验证实具有良好的成骨活性。
复合材料特性改变方面，微球掺入后材料的固化时间轻度增加，但并不影响其临床应用时的操作，生物力学测定结果显示，随PLGA量的增加，复合材料的抗压强度逐渐下降，由原来的29 MPa下降至82 MPa,抗压强度下降及固化时间的延长可能与微球的掺入阻止了CPC骨水泥HA晶体间的相互交联有关［8］。复合材料强度虽有下降，但仍明显高于PLGA微球降解之后材料的强度，接近松质骨的抗压强度(8～10 MPa)。根据相关的，作者选用PLGA／CPC体积比为60∶40的复合材料进一步研究，理论上的及以往的研究显示：在带有孔隙的基质材料中当空隙与材料的体积比大于04时孔隙即可相互交通［3］。本实验复合材料的扫描电镜结果显示，微球降解之前相互连接，降解之后产生的微孔能通过CPC中固有的微孔使其相通。
本实验通过降解液的Ca、P浓度变化反映材料的降解速度，结果显示，2周之前两者降解速度无差别，随后差别逐渐加大。造成降解速度差别的原因主要与 PLGA微球的降解有关。PLGA的降解方式主要为水解，其水解之后所产生的乳酸可造成局部酸性的增加，从而加快CPC的降解速度［7］，此外，复合材料植入体内后期随微球的降解形成微孔会使得材料的降解速度加快，孔隙率和局部的酸碱度为影响材料降解的主要因素。另一方面，PLGA降解时若局部酸性程度过高会刺激机体产生无菌性炎症，而CPC固化后形成的偏碱性的HA可以中和PLGA降解产生的酸性物质，从而达到优势互补、扬长避短的效果，这一点可以从材料降解液的pH值的变化中得到证实。
研究发现CPC可以作为生物活性因子的良好载体，其所携载的生物因子能够缓慢持续释放并保持活性［8,9］，但由于CPC降解过慢，同时HA与活性因子蛋白具有高度的亲和力，因而蛋白的释放速度相当缓慢，不利于生物因子活性的发挥［10］。根据复合rhBMP2的复合材料及单纯CPC的活性因子载体体外释放测定结果,PLGA微球的加入使得材料的rhBMP2释放速度明显加快，其原因在于一方面PLGA微球本身降解较快，同时其加入也促进了CPC的降解，使得复合材料的药物释放加快。
骨形态发生蛋白(BMPs)是一组存在于骨基质中具有诱导骨生长的复合物。实验表明，新骨的形成量和BMP的植入量呈正相关［8］。本实验采用体外细胞培养法检测复合材料释放的rhBMP2的活性，从实验结果可以看出，释放的 rhBMP2作用于MSCs后，反映细胞增殖指征的MTT无明显变化，因为rhBMP2是一种强促分化剂，它不促进细胞的增殖。ALP活性被认为是衡量多种细胞向成骨细胞方向分化的程度和成骨细胞功能状态的一个重要指标。实验中当运用复合材料不同时间点的rhBMP2释放液作用于MSCs后，细胞ALP较空白对照组明显升高，且复合材料组ALP活性高于单纯rhBMP2／CPC组，说明释放rhBMP2仍保持其诱导成骨分化的活性，成骨活性遵从剂量依存效应。
综上所述，本研究将通过复乳溶剂挥发法制备的rhBMP2／PLGA载药微球加入CPC粉末中，制备可注射、自凝固的复合活性人工骨，通过检测证实载有 rhBMP2的PLGA微球的掺入可明显提高材料的降解速度和活性因子rhBMP2的释放，同时释放的rhBMP2仍保持良好的活性。初步证明，作者所制备的 rhBMP2／PLGA微球／磷酸钙骨水泥复合人工骨作为骨修复材料和活性因子的载体具有良好的应用前景。目前作者正在对复合材料的体内降解性成骨活性进行进一步研究。
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