降钙素对兔骨关节炎关节软骨的保护作用
【关键词】 降钙素
摘 要：［目的］研究降钙素(calcitonin，CT)对骨关节炎关节软骨的保护作用。［方法］6个月龄新西兰大白兔20只，随机分为两组均行右膝关节前交叉韧带切断术。1周后实验组开始皮下注射降钙素5 IU／kg，每日1次；对照组注入等剂量生理盐水；术后6周处死动物。取股骨内髁制成切片行HE、番红“O”和Ⅱ型胶原免疫组化染色。HE切片按照Mankin评分表评分。番红“O”染色和Ⅱ型胶原免疫组化染色切片用图像分析仪，测量平均灰度值。［结果］(1)对照组术侧膝关节组织学Mankin评分结果、番红“O”染色和Ⅱ型胶原免疫组化染色平均灰度值测量结果高于健侧，（P<001）。（2)对照组手术膝关节组织学评分、番红“O”染色和Ⅱ型胶原免疫组化染色平均灰度值测量结果高于实验组手术膝关节，（P<005）。［结论］降钙素5 IU/ kg每日1次皮下注射够明显减轻兔膝关节不稳定诱发的骨关节炎关节软骨的退变。降钙素可能通过提高软骨基质糖胺多糖(glycosaminoglycans，GAG)和Ⅱ型胶原含量保护关节软骨。
关键词：降钙素； 骨关节炎； 灰度值
Abstract：［Objective］To assess whether calcitonin exerts an chondroprotective action in unstable knees which induce experimental osteoarthritis. ［Method］Twenty 6month New Zealand rabbits were divided into two groups randomly. All rabbits underwent anterior cruciate ligament transection (ACLT) on the right knee. Rabbits of experimental group began to receive a daffy subcutaneous injection of salmon calcitonin at a dose of 5 IU per kg of body weight on day 7 postsurgery; in contrast ,control group received normal saline (NS) at the same dose. All rabbits were killed on day 42 postsurgery. The knee joints were examined grossly and histologically and scored; the medial condyle sections were stained with Safranin O and immunohistochemistry of collagen II. We applied a computer graphic technology to assess the glycosaminoglycans (GAG) and collagen II of articular cartilage. ［Result］(1) In control group, compared uninjured knee joints with operative knee joints,the appearance of operative knee joints accorded with OA and histologic score of operative knee joints were higher than that of uninjured knee joints,P<0.01; the grey value of Safranin O and collagen II of operative knee joints were greater, too.(2) Compared control group with experimental group,the histologic score, the grey value of Safranin O and collagen Ⅱ control group were higher than that of experimental group. ［Conclusion］ A daily subcutaneous injection of salmon calcition at a dose of 5 IU/kg of body weight exerts an chondroprotective action in these unstable knee joints models. Calcition probably protects articular cartilage by increasing GAG and collagen Ⅱ.
Key words:Calcition; Oseoarthritis; Grey Value
骨关节炎(osteoarthritis，OA)是老年人常见的疾病之一。60岁以上人群患病率达50％，75岁以上人群患病率约为80％，该病最终致残率为53％［1］。随着社会人口老龄化，研究该病的也渐增多。降钙素在体外细胞培养中可以刺激软骨细胞的分化和成熟，促进软骨细胞分泌基质［2、3］。在动物实验中也显示了很强的软骨保护作用［3、4］。本文用兔子不稳定膝关节诱导骨关节炎模型，研究降钙素对关节软骨的保护作用，为其临床应用提供依据。
1 材料与方法
11 动物分组与处理
健康6个月龄雌性新西兰大白兔20只(购自北京大学医学部实验动物中心，批号：HCSCXK(京)2002-0005，体重(214～015)kg。随机分为两组，行右膝关节前交叉韧带切断术(anterior cruciate ligament transection，ACLT)，术后3 d之内每日1次肌注青霉素20万U／只。自术后1～6周，实验组(ACLT+CT组)每日１次皮下注射降钙素(瑞士诺华制药有限公司生产，批号：H20040452)5 ＩU／kg，实验对照组(ACLT组)予等剂量生理盐水皮下注射。术后6周处死动物。对照组左膝关节作为空白对照与右侧膝关节对比以确定造模是否成功。对照组和实验组右膝关节对比确定降钙素对关节软骨所起的作用。
12 标本采集和处理
动物处死后，立即解剖膝关节，肉眼观察滑膜、滑液性状，以及关节面色泽、光滑度。切下股骨髁置于4％多聚甲醛中固定，15％EDTA2Na溶液脱钙，石蜡包埋，沿正中矢状面作6 μm薄切片。切片行HE染色、番红“0”(Safranin 0)染色、Ⅱ型胶原免疫组化染色。
13 Ⅱ型胶原免疫组化
6 μm连续切片，置多聚赖氨酸包被的载玻片上，常规脱腊至水。01％曲拉通01 mol枸橼酸溶液和3％过氧化氢溶液在室温下各浸泡15 min。抗原修复后羊抗兔Collagen Ⅱ单克隆抗体(购自天津灏洋生物制品有限公司)1：100稀释滴加切片组织上，放入湿盒内4℃孵育24 h。生物素化二抗滴加切片组织上37℃孵育1 h。滴加辣根过氧化物酶标记的三抗，室温孵育20 min。DAB显色，苏木素复染。
14 观察指标
光镜下双盲法按Mankin法［5］评分；番红“0”染色和Ⅱ型胶原免疫组化染色切片用HPIAS-1000系列多功能真彩色病理图像分析系统软件分析，分别于10倍物镜下以负重区为中心，在关节软骨图像辐射层和柱状层各随机取10个区域测定其灰度值以均值表示测定结果。
15 统计学分析方法
全部数据采用spss100统计软件，作t检验。
2 结 果
21 肉眼大体观察结果
对照组健侧膝关节外观正常，关节滑液清，关节面光滑，关节软骨略显淡蓝色，有光泽。对照组术侧膝关节肿胀严重，胫骨平台和股骨髁均可见骨性肥大。滑液色黄且混浊，滑膜亦呈黄色。关节面粗糙不平整、无光泽，颜色暗红，关节软骨破坏，关节边缘有大量骨赘形成，符合骨关节炎病理特点。实验组术侧膝关节稍肿胀，未见胫骨平台和股骨髁有骨性肥大。滑液淡黄色。关节面欠光滑，无光泽，部分区域颜色发暗，有少量骨赘形成。实验组手术膝关节损害较对照组手术膝关节轻。
22 细胞形态学观察
对照组健侧膝关节股骨内髁关节面平整，光滑，HE染色基质染成粉红色，着色均匀，软骨细胞核呈深蓝色，细胞层次清楚，排列整齐，大小均一(图1)。
对照组术侧标本可见关节面大部分区域粗糙，可见达软骨中层和深层的裂隙或缺损，裂隙周围可见大量细胞克隆现象及克隆细胞周围大量软骨细胞消失(图2)，基质染色重度不均，软骨细胞排列紊乱；有的区域软骨细胞核消失，留下空的软骨囊。有的切片可见明显的丘状隆起的骨赘。
实验组术侧部分区域关节面粗糙；基质染色中度不均，可见细胞簇聚多见，有的可见少量的软骨细胞坏死区，细胞克隆现象偶见(图3)。按Mankin评分标准结果见表1。表1 三组膝关节标本光镜下Mankin评分结果(略)
23 三组膝关节番红“0”和Ⅱ型胶原免疫组化染色切片灰度值
番红“0”染色软骨细胞核和基质均染成粉红色，空白对照组着色均匀；ACLT组基质染色重度不均，可见细胞克隆和细胞减少；ACLT+CT组可见关节面粗糙，基质染色轻度不均(图4～6)。Ⅱ型胶原免疫组化细胞基质染成棕黄色，各组情况与番红“0”染色相似(图7～9)。灰度值测量结果见表2。表2 番红“0”及Ⅱ型胶原免疫组化灰度值(略)
3 讨 论
本实验结果发现细胞组织形态学评分对照组术侧膝关节明显高于对照组健侧。表明本实验的骨性关节炎动物模型复制成功。番红“0”染色灰度值和II型胶原免疫组化染色灰度值测量术侧高于健侧，表明术侧GAG和Ⅱ型胶原含量低于健侧，说明在OA进程中伴随着GAG和Ⅱ型胶原的破坏和丢失。
实验组术侧和对照组术侧关节细胞组织形态学评分后者明显高于前者，说明对照组术侧关节软骨损害大于实验组术侧，表示降钙素对关节软骨有保护作用，这与Badurski［3］和Manicourt DH［4］等研究结果一致。同时，对照组番红“0”染色灰度值和Ⅱ型胶原免疫组化染色灰度值测量显著高于实验组，说明对发生OA的关节软骨，降钙素促进了软骨细胞分泌GAG和Ⅱ型胶原，或阻止了这两种物质的分解。
在以兔作为实验动物制作的骨关节炎模型中，Badurski采用了每次给药7 IU／kg，每周2次的用法，相当于每天2 IU／kg［3］。为了尽量与降钙素临床应用方法相近，本实验用每天给药1次的方法。使用剂量以人的标准剂量1～2 IU／kg为基准，经过人与动物剂量换算公式设定为5 IU／kg，高于Badurski的2 IU／kg。实验结果证明了这种剂量的降钙素对OA有保护作用，据此推断临床应用降钙素骨质疏松的常规剂量1～2 IU／kg可能对骨关节炎有治疗作用，值得进一步临床观察研究。
降钙素对关节软骨保护作用的机制尚在探索。有许多实验报告，降钙素可以使软骨细胞合成糖胺多糖的能力增加。用体外培养胎牛股骨软骨细胞摄取14C标记的葡萄糖的方法证明了这一点［6］;体外软骨细胞培养对４５Ca追踪测量法证实了降钙素能够促进软骨细胞合成糖胺多糖和对钙的摄取；Bassleer［7］等用三维培养系统培养了人股骨头软骨细胞，也直接证实了这一现象。Badurski［3］利用直接提取GAG的测量方法，证明应用降钙素的实验组动物关节软骨GAG含量高于对照组。本实验中观察到番红“0”染色灰度值对照组术侧高于实验组术侧，用半定量测量的方法证实了降钙素使关节软骨基质中GAG丢失明显减缓，与Badurski的结果一致。Weiss［2］等指出，软骨细胞在降钙素的作用下，合成3H-胸腺嘧啶的量增加了2倍，GAG增加了52％，软骨细胞基质钙含量增加了66％，而且降钙素还加强成纤维细胞生长和胶原的合成。Bassleer［7］通过细胞培养也证实了降钙素能促进Ⅱ型胶原的合成。这些研究均于体外细胞培养。本实验通过免疫组化方法，从动物体内实验的角度证实了使用降钙素对动物关节软骨Ⅱ型胶原有保护作用。
GAG和Ⅱ型胶原是关节软骨的主要成份，后者维持空间网格结构，GAG分布其中，结合大量的水分。二者共同赋予了关节软骨的弹性和硬度。在骨性关节炎关节软骨的退变过程中，首先是基质结构遭到破坏，基质主要成分含量减少，其中GAG和Ⅱ型胶原的破坏最为显著，影响了关节软骨的正常生理功能。降钙素能够促进这两种物质的合成，必然有利于保护关节软骨。
降钙素保护关节软骨的机制可能还有：抑制软骨基质钙和软骨下骨磷的释放，阻止关节内结晶的形成；通过β-内啡肽调节关节软骨代谢；抑制软骨下骨的吸收，使其硬度得以保持，从而保护了其上的关节软骨。新的研究表明骨形成蛋白(bone morphogenetic protein，BMP)家族在有强的成骨活性同时，有较强的成软骨活性［8,9］，降钙素是治疗骨质疏松的常用药物，有可能通过促进BMP分泌保护了关节软骨。
通过本实验可以看出降钙素对不稳定膝关节的关节软骨基质的主要成分――GAG和Ⅱ型胶原的丢失有较好的拮抗作用，而基质成分的稳定必然有利于关节软骨保持其硬度和弹性，从而增强对抗各种损害因素的能力，延迟退变。
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