短程免疫法制备抗血清效果比较

【摘要】  探讨快速制备抗血清的方法和效果,以适应其在实验教学中的需要。方法 采用短程免疫法，对家兔分组，用大肠杆菌抗原菌液、绵羊红细胞(SRBC)抗原和鸡蛋黄抗原小剂量连续多次接种后，收集抗血清，对其效价进行测定,并与传统抗血清制备方法进行比较。结果 经大肠杆菌抗原、绵羊红细胞(SRBC)抗原和鸡蛋黄抗原免疫后的抗血清最终分别达到1∶10240、1∶1200和1∶10240的高效价。结论 此方案制备抗血清所用时间短，效价高，亲和力强，适用于实验教学。

【关键词】  抗血清 短程免疫 标本制备 免疫学试验 效价

  
    Abstract:Objective: To explore the methods of producing immune serum and its effect on short-term immunization, in order to meet its experimental teaching needs.  Methods: By the means of  short-term immunization, rabbits were immunized with E. coli, Sheep red blood cells and yolk antigen instantly for 5 times with small dose, then the serum was picked up to obtain the r-globulin. The titer of antibody was checked up, and were compared with the traditional anti-serum preparation methods. Reslults: The titer of antiserum from E. coli antigen, Sheep red blood cells antigen and yolk antigen reached high up to 1:10240 ,1:1200 and 1:10240 separately .  Conclusion: The antiserum prepared by short?term immunization has high-titer and high-affinity, is applicable to experimental teaching.

    Key words:antiserum; short?term immunization; preparation of samples; immunological tests; titer

    抗血清是经过抗原免疫的动物血清，含有特异性免疫球蛋白(Ig)，可直接应用于病原体的诊断或感染性疾病的紧急预防和，也可通过进一步纯化血清中的Ig，用于多种疾病的诊断和治疗，是一种非常重要的生物制品。鉴于抗血清在临床免疫学检验中的广泛应用，如何制备抗血清成为学生必需具备的实验技术。在以往的抗血清制备实验课中,制备高效价抗血清基本采用大剂量长程免疫法，该方法具有产物效价高、亲和力强的优点，但耗时过长，给研究造成一定的影响。为了探索快速制备抗血清的新方法 ,本研究选取大肠杆菌抗原和绵羊红细胞(SRBC)抗原代表颗粒性抗原，选取鸡蛋黄抗原代表可溶性抗原［1］,采用小剂量短程免疫法制备抗血清 ,以探讨该方法的可行性。

    1  材料与方法

    1.1  试剂与器材

    1.1.1  抗原  大肠杆菌（泰山医学院临床微生物学教研室保存）；绵羊红细胞(SRBC)；新鲜鸡蛋。

    1.1.2  实验动物  健康家兔32只，雄性，体重2.0～2.5 kg，无免疫史，由泰山医学院实验动物中心提供，随机分成4组。

    1.1.3  器材与试剂  紫外分光光度计；摇床恒温水浴箱；离心机；振荡器；灭菌大试管；LB液体培养基或肉汤培养基；麦氏比浊管；0.5%石炭酸溶液；磷酸盐缓冲液；盐酸溶液；HRP?Ab等。实验用材料均需灭菌处理。

    1.2  抗原的制备

    1.2.1  大肠杆菌抗原的制备  将大肠杆菌接种到营养琼脂培养皿上，37 ℃培养18～24 h，取单菌落接种于LB液体培养基或肉汤培养基中，37℃培养18～24 h，按照1%的比例转种于LB液体培养基或肉汤培养基中，37 ℃培养18～24 h，收集培养液。沸水浴1 h后3000 r/min离心10 min，弃去上清。麦氏比浊法，用石炭酸生理盐水稀释至109个/ml，取少许做无菌实验，其余菌悬液放冰箱保存。

    1.2.2  SRBC抗原的制备  无菌抗凝绵羊血2000 r/min离心5 min，吸去上清，加入等量无菌生理盐水混匀，2000 r/min离心5 min，吸去上清，如此连续洗3次，最后一次可离心10 min以使红细胞密集管底，直至上清液透明无色再吸去上清液，留密集红细胞备用。用无菌生理盐水将红细胞配成20 %SRBC悬液，即为试验用的SRBC悬液。

    1.2.3  鸡蛋黄抗原的制备  取新鲜鸡蛋一个，用75 %酒精消毒，在无菌条件下，于气室一端击一小孔，用无菌吸管将蛋清吸出后，将蛋黄倒入一装有玻璃珠的无菌锥形瓶内摇匀，用生理盐水进行1∶5稀释，置4 ℃冰箱保存备用。

    1.3  免疫方案表1  短程免疫方案

    1.4  试血

    末次免疫后第3天，耳动脉采血2 ml，37 ℃温育1 h后，2000 r/m离心10 min，吸取离心后上清液0.2 ml于无菌试管中，再加入0.8 ml生理盐水，作 1∶5 稀释。

    1.4.1  初步测定大肠杆菌抗原抗血清效价  采用试管凝集试验方法进行测定。

    1.4.2  初步测定SRBC抗原抗血清效价  采用试管凝集试验方法进行测定。

    1.4.3  初步测定蛋黄抗原抗血清效价　采用琼脂凝胶双向扩散试验方法进行测定。

    末次免疫后第六天，心脏采血法［2］采取20 ml血液于离心管中，放37 ℃温箱凝固，出现血凝块后3000 r/m离心20 min，将上清液转移到洁净试管中，-20 ℃冰箱保存。

    1.6  鉴定抗血清终效价

    1.6.1  ELISA法鉴定大肠杆菌、蛋黄抗血清终效价［1,3］

    1.6.2  补体溶血试验鉴定SRBC抗血清终效价

    2  结 果

    2.1  抗血清效价的初步检测结果

    经大肠杆菌抗原、SRBC抗原、鸡蛋黄抗原免疫后的抗血清效价分别达1∶1280、1∶640、1∶32。

    2.2  抗血清终效价结果

    经大肠杆菌抗原、鸡蛋黄抗原、SRBC抗原免疫后的抗血清效价分别达1∶10240、1∶10240和1∶1200。

    3  讨 论

    目前，高效价抗血清的制备基本采用长程免疫法，抗血清的制备过程耗时一个多月。虽然长程免疫法制备的抗血清效价高、亲和力强,但是其操作过程较长 ,期间可能有动物死亡等不利因素。短程免疫法在中尚不多见，将免疫时间缩短来制备抗血清的方法和效果是值得探讨的。

    本研究选择大肠杆菌抗原和SRBC抗原代表颗粒性抗原，选择蛋黄抗原代表可溶性抗原，采用短程免疫法，5天内分组连续免疫家兔，末次免疫后第3天试血，抗大肠杆菌抗原和绵羊红细胞抗原抗血清的效价已分别达到1∶1280和1∶640，而抗蛋黄抗原抗血清的效价仅达到 1∶32，这与抗原的种类及物理性状对免疫原性的影响有关［4］，大肠杆菌抗原SRBC抗原为颗粒性抗原，蛋黄抗原为可溶性抗原；颗粒性抗原的免疫原性较可溶性抗原强，故试血时效价前者高于后者。但是末次免疫后第6天采血,用补体溶血试验测得绵羊红细胞免疫动物的抗血清(溶血素) 效价达1∶1200，用特异性和灵敏度均较高的 ELISA 间接法测定，大肠杆菌抗原和鸡蛋黄抗原抗血清的效价均达到1∶10240。因此可见，短程免疫法不仅缩短了免疫期限，而且具有较好的免疫效果，可制备出高效价、高亲和力的抗血清。

    通过本次实验的设计及实验过程和结果来看，整个实验过程的操作简单易行, 效果高，用时短。更重要的是,本实验包含了抗原的制备、免疫动物、抗血清的采集、抗体的鉴定、分离提纯、抗体的效价检测等内容，是一项综合性系统性实验，是免疫学及免疫学技术的浓缩［5］。该实验既提高了学生的理论水平，又培养了学生运用理论指导实践，在实践过程中发现问题、分析问题和解决问题的能力。因此，我们认为这种系统性实验包括了免疫学实验课的经典实验内容，且实验期限较短，适用于实验教学。

【文献】
  ［1］ 朱振久，张冉，杨惠军，等.短程免疫法制备高效价抗血清研究［J］.湖南师范大学学报，2006，3（1）:42.

［2］ 王娅，王全勇，王淑兰.伤寒、副伤寒免疫血清的制备［J］.数理医药学杂志，2005，18（2）：178?179.

［3］ 郭利军，武有聪，申元英，等.一种适用于教学的酶联免疫吸附试验的抗原抗体系统制备［J］.大院学报，2007，6（2）：21.

［4］ 王兰兰.临床免疫学与检验［J］.第4版. 北京:人民卫生出版社 ,2007.21?32.

［3］ 覃艳春，陆金兰，陆吉利，等.免疫血清制备方法改良初探［J］.右江民族医学院学报，2005，27（6）：892.