机械牵张应力对成骨细胞的影响研究进展

            作者：黎润光,邵景范,魏明发

【关键词】  机械牵张

    正常骨骼处于一个吸收与生长重建的连续过程，成骨细胞与破骨细胞的生理活性保持着动态平衡，机械力学刺激是必不可少的条件之一。大量研究表明：机械力学刺激过低时，如宇航失重和长期卧床、肢体制动的人员均可导致骨密度、骨钙含量、骨基质蛋白、骨形成速度的降低；而绝经后妇女进行适当的活动锻炼、增加骨骼载荷，可减少其骨质疏松的发生。体内力学环境复杂，而离体实验可以通过设计特定的加载方式，来控制各种变量(力学的不同类型、大小、频率、时间和细胞的不同种系等)，观察细胞对力学刺激的响应。体内实验及临床应用，发现适当的牵张应力在骨折修复、正畸牙移动以及牵拉成骨(颌骨发育不足的矫治、骨缺损的整复、肢体延长)等中，能刺激骨组织自身生长与重建。成骨细胞是其中重要的感受与效应细胞，可通过力敏感离子通道、G蛋白与酪氨酸激酶、整合素受体与细胞骨架等多种途径，感受体内外力学刺激，并将力学刺激信号转化为细胞生物化学信号，介导力相关敏感基因表达，合成各种酶类等活性物质，激活信号级联反应，参与一系列复杂的生理病理活动。国内外有关机械牵张应力对体外培养成骨细胞影响的研究，为牵张应力在骨科的应用提供了大量的理论和实验依据。

    1  牵张应力特点与加载装置的原理

    在体内应力的作用下，骨组织变形，附着于骨基质上的成骨细胞可产生相应的牵拉变形，据此，牵拉张力的加载装置［1］主要是通过各种方法对培养基膜的牵拉(如图1～9)，使黏附于基膜上的成骨细胞被动伸展。应用此力学装置，能较好地模拟体内骨组织的受牵拉时的力学环境，可以给予细胞静止性或周期性、单向或双轴的牵拉，牵拉力大小及时间频率可以量化，加载刺激时或刺激前后均可用显微镜观察细胞情况，装置应用简单方便，价格便宜，重复性好。但牵拉张力装置依赖于培养基膜与细胞之间的作用，培养基膜各区域细胞受力不均匀，中间区域的细胞受力较小；而且体外培养基的应变明显大于骨基质，在单轴牵拉中，牵拉轴的垂直方向可对细胞产生收缩压力；在周期性培养基膜屈曲形变时，若屈曲率过大也会产生流体剪切力，这些都增加了干扰因素。成骨细胞经24 h培养，在基底膜完全贴壁、铺展后，细胞贴壁面面积为未贴壁前球状体俯视面积的4～5倍以上，厚度从边缘到最大处从零开始逐渐变化，按惯例此时通过对基底材料拉伸，给予细胞力学加载，在1 h内可达到最大增殖效果［2］，细胞这种铺展厚度变化特点使得细胞在随基底材料膜拉伸时，便于其内应变趋向更均匀一致。早期学者开展细胞培养的机械力学加载研究，在设计张力装置时，曾使用“悬滴培养”作局部牵拉的方式。目前，实验装置、材料及原理均得到了很大的改进，大多使用弹性恰当的硅胶或生物高分子材料作培养基膜，用钛合金等对细胞无影响的材料作支架，更能模拟体内受牵引时的力学环境，其中使用最多的是“四点弯曲”、“Flexercell”及“均匀双轴”等模型。席雨涛［3］在研究心肌细胞受牵张刺激时，研制了一种新型的离心力牵拉装置(如图10)，其原理为：将贴有细胞的培养板置于匀速水平旋转的平台上，并以一定的速度旋转，使贴壁细胞产生一向外的离心力，从而被牵张。每个细胞距轴心的距离是恒定的，可通过控制转速相应控制作用于细胞的牵张力大小。

    2  牵张应力对成骨细胞的生物学效应

    机械应力可以引起骨代谢发生改变，但在体外实验，由于牵张应力的大小、频率、时间及使用装置不同，对成骨细胞的影响有所不同。一般来说，周期性应力对细胞的增殖功能及基因表达的作用明显大于持续性应力的作用。至于应力刺激成骨细胞的最佳频率大小、时间，不同的实验室报道有较大的差别，有时在同一实验，促进成骨细胞增殖的最佳力学条件却与酶分泌峰值也不同。

    （1）细胞增殖周期及形态结构变化：众所周知，骨组织受过小或过大的力学刺激分别会导致废用性骨丢失及病理性编织骨，只有生理范围内的力学刺激才会加强骨的建造。唐丽灵等［4］用四点弯曲装置向成骨细胞加载不同水平的应力，发现500μ ε作用24 h后，成骨细胞的G2M期及S期的细胞数目增加，增殖指数上升，促进细胞增殖；而用1 000μ ε时，细胞周期情况却相反，处于G0G1期的细胞反而多，增殖指数下降，增殖受抑制。F．A．A．Weyts等［5］认为张力对成骨细胞增殖的影响与其分化时相有关，作者对人胎儿不图1  纵向单轴牵拉培养基膜  图2  纵向支点弯曲培养基膜  图3  曲状底物向上隆起培养基膜  图4  培养基膜中心被底物隆起  图5  真空负压向下吸引培养基膜使中心种植细胞的培养基区域牵拉  图6  流体正压向上隆起培养基膜  图7  光滑环状平板托起培养基膜，使培养基膜水平平均向牵拉  图8  光滑环状平板支撑培养基膜，周围受真空负压吸引，使培养基膜水平均向牵拉  图9  垂直双轴牵拉培养基膜  图10  离心牵拉装置同分化时相(7、14、21 d)的成骨细胞给予相同条件的张力刺激，分化7 d的细胞反而触发凋亡，14 d以后的细胞才出现增殖，到分化21 d的细胞增殖又变得不明显。L.C．Winter等［6］用周期性和连续性的拉力加载，成骨细胞内的DNA及Ca含量均较对照组增高，而且周期拉力对细胞的改变更明显。在细胞形态方面，Akhouayri等发现动态载荷细胞会变大变圆，而静态载荷细胞被拉伸并沿拉伸轴排列；戚孟春等［７］对成骨细胞给予张力牵拉后，细胞骨架形态发生改变，微丝蛋白解散重排，Factin纤维束变得细而稀疏，这种细胞骨架变性现象在流切力、离心力等加载成骨细胞中也可以看到，与力转导信号有关。王红兵等［8］采用四点弯曲实验装置对离体培养的大鼠成骨细胞施以拉伸应变，发现加载初期细胞粘附力急剧上升，4 h后下调，加载24 h(500μ ε)实验组细胞的粘弹性参数较对照组低，可能与加载后细胞骨架及细胞粘附调整有关。细胞粘附、铺展是细胞表面与基底膜相互作用的结果。机械拉伸可通过促进细胞粘附铺展影响细胞生长、增殖，但超出细胞粘附力的拉伸刺激可导致细胞损伤、粘附面减少甚至脱落。

    （2）细胞内基因及酶类表达的调节  大量实验表明，适当的应力载荷，可以促进成骨细胞内的力敏感基因表达，如早期反应基因(cfos、cjun、cox2)、ALP及骨钙素、骨形态形成性蛋白及其受体［9］、胶原蛋白［10］、OPN、VEGF［11］等，诱导成骨细胞自身的分化增殖，调节其生理功能，有助于基质矿化与骨重建。王鹏程等［12］研究成骨细胞(MC3T3E1)的三维牵拉载荷时，发现基质蛋白matrilin2表达增强。matrilin2是成骨细胞外基质的重要组成部分，随着成骨细胞的增殖与分化，其含量逐渐增加，是成骨细胞分化的标志。李良等［13］对鼠颅骨原代成骨细胞行双轴周期性牵拉张力刺激的研究，发现整合素(Integrins α2，β1，β3)表达增加，其中1 000 μ ε时，Integrins β1表达量增加最强。整合素是连接细胞内外信号传递的重要物质。M．M．Saunders等［14］对人骨肉瘤细胞(MG63)进行培养基膜周期性(Hz为0．9)弯曲张力作用2 h再孵育1 h后，发现骨保护素(OPG)及PGE2明显上调，核因子-κ B配体(RANKL)略有上升，但OPG／RANKL明显增大，成骨细胞分泌的OPG可以和RANKL结合从而竞争性阻滞了破骨细胞表面的RANK与RANKL结合，达到调控破骨细胞的分化和功能作用。Takahiro Kanno等［15］，研究牵张成骨术对骨膜细胞向成骨细胞分化影响，对离体的下颌骨骨膜细胞给予培养基膜拉伸12％，频率为1／20 Hz的正弦式张力加载，作用4 h和8 h后，PCR测得转录因子Runx2 mRNA浓度均较对照组增大。Runx2是成骨细胞分化的必需的转录因子，从而表明牵张力可以促进成骨细胞的自身分化。过大的载荷对成骨细胞产生负性影响。N．Yamamoto等［16］对成骨样细胞HT3给予过大的牵拉张力刺激，发现成骨细胞内产生大量活性氧簇(ROS)，并呈牵拉时间、强度依赖性变化，以及相应的超氧化物歧化酶(SOD)活性增强。细胞松解素D可以阻滞ROS的增加效应，而线粒体复合酶I的抑制剂(鱼藤酮)可以促进ROS的增加效应，提示细胞骨架肌动蛋白丝和线粒体链参与此过程。

    3  机械刺激在细胞应答中的信号传导过程

    机械载荷刺激细胞组织后，其基本的机械力学生物化学转导机制与调节过程具有相同信号途径，主要为3条：通过细胞外基质信号―跨膜整合素―细胞骨架构像改变对信号的传递。激活细胞膜力敏感离子通道介导细胞内钙离子水平升高，触动G蛋白偶联酪氨酸激酶磷酸化与MAPKs调节的级联反应，各信号分子之间存在状调控，最后导致转录因子的激活。但不同的细胞类型对于不同的机械刺激有其不同特点。在成骨细胞应答机械力学刺激中，对力学敏感的钙离子通道复合体、G蛋白、整合素、各生长因子受体位于细胞膜表面或跨膜存在，这些都将细胞外基质信号传递入细胞内。（1）钙离子通道复合体本身既有信号结合位点，又是离子通道，被激活后，直接促动钙内流，使胞内钙离子浓度增高；（2）跨膜G蛋白通过CA偶联活化，介导第二信使(cAMP及PI)途径传导信号。CAMP水平变化介导PKA，PKA活化后导致CREB磷酸化等。PI激活PLC，后者水解PIP2产生IP3和DAG，IP3可以与内质网的IP3受体结合，使内质网储存的钙释放；DAG则通过活化PKA，然后介导MAPK和核因子-κ B通道，其中核因子-κ B活化后易位入胞核，结合位点调节转录；（3）整合素α、β也为跨膜，受机械刺激后其配体增多并与整合素结合。整合素［17］作为联系细胞内外信号的主要物质，通过以下3个方面起作用的：导致细胞骨架重排、微丝蛋白构象改变，最后与染色体接触引起细胞功能改变；调节胞膜钙离子通道以及导致PLC介导的IP3活化，共同作用使胞内钙浓度增高；通过FAK／SOS／Ras等通道，使MEK1、ERK1／2等磷酸化，活化转录因子Runx2(Cbfal)［18］和AP1家族；（4）细胞膜上的各生长因子受体，如：TGFβ、ILGF、EGF等，与机械刺激产生的生长因子结合，通过MAPKs途径，激活转录因子；（5）钙离子是细胞内重要的第２信使，多个信号传递途径都需要Ca的参与，给予钙离子拮抗剂［19］，可以阻滞信号转导过程。例如Ca可与相应的钙结合蛋白结合，改变其构象，活化相应激酶，从而活化CREB及组织特异性转录因子NFAT等；（6）根据以上途径活化的各转录因子，易位入胞与相应的位点结合，介导基因(cfos、cjun、COX2、egr1等)表达，分泌蛋白酶细胞因子，参与调节信号传导以及促进细胞增殖分化等生物效应。事实上，上述的成骨细胞对力学的刺激应答过程远未能揭示其全貌，其中各途径各信号因子间相互影响，构成网络样调节，共同激活转录因子，引发基因表达。在力学转导过程中，MAPKs的途径在不同的研究中，所得的结果差异较大，例如H．L.Jessop等［20］比较研究流体剪切力与牵拉张力对成骨细胞系(ROS 17／28)中，发现ERK的调节激活途径不同。

    4  总  结

    利用力学装置加载应力于成骨细胞，模拟在人体正常生理状态时力学环境，观察成骨细胞的生物学效应及力学转导机制是目前研究的热点之一。给予成骨细胞牵拉张力刺激，探索成骨细胞生长状况以及最佳的力学环境，为牵拉应力在骨科的应用以及为培养人工骨组织提供理论依据；此外，探讨疾病模型下，如：骨质疏松、缺血缺氧的成骨细胞对应力的作用，能进一步揭示骨组织的病理生理过程，为临床提供新的方法。

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