乳腺癌转移抑制基因BRMS1真核表达载体的构建及鉴定

            作者：唐鲁兵 高海东 田春艳 孙靖中 刘焕涛 马榕 王甜甜   

【摘要】目的：构建乳腺癌转移抑制基因（BRMS1）真核表达载体pcDNA3.1/mycBRMS1，为研究抑制恶性肿瘤转移的机制奠定基础。方法：设计含有Hind Ⅲ和XhoⅠ酶切位点的一对引物，应用逆转录聚合酶链式反应（RTPCR）技术从人乳腺癌细胞株MCF7中扩增到BRMS1的cDNA基因片断，经回收、纯化、酶切后，连接到质粒pcDNA3.1/mycHis(+)A上，鉴定正确后并转染人胚肾细胞HEK293进行Western blot验证其是否表达。结果：琼脂糖凝胶电泳及基因测序证实重组的pcDNA3.1/mycBRMS1 cDNA的碱基组成与GenBank中的人BRMS1 cDNA的基因片断组成相同。结论：成功构建了乳腺癌转移抑制基因BRMS1真核表达载体并测序鉴定。

    【关键词】乳腺肿瘤・转移抑制基因・BRMS1・基因表达

    Construction and identification of eukaryotic expression vector for human breast cancer metastasis suppressor1(BRMS1)

       【ABSTRACT】Objective:To construct recombined eukaryotic expression vector pcDNA3.1/mycBRMS1cDNA successfully.This is useful for researching the mechanisms of metastatic suppression.Methods:To design a pair of primers,which two restriction site with HindⅢ and XhoⅠ,and BRMS1cDNA fragments were amplified from human breastcancer MCF7 by RTPCR.The product was extracted,purified and digested with Hind Ⅲ and Xho Ⅰ,then was inserted to PcDNA3.1/mycHis(+)A plasmid.The recombinants transfected into HEK293 cell and was identified by Western blot.Results:The base sequence of recombined pcDNA3.1/mycBRMS1cNDA was in accordance with human BRMS1 cDNA fragments by agarose gel electrophoresis and DNA sequence analysis.Conclusion:Eukaryotic expression vector for human breast cancer metastasis suppressor 1(pcDNA3.1/mycBRMS1)has been constructed successfuly and DNA sequence was analyzed.

    【KEY WORDS】Breast neoplasms ・Metastasis suppressor gene・BRMS1・Gene expression   

    与乳腺癌转移有关的基因分为转移促进基因和转移抑制基因两大类。乳腺癌转移抑制基因1（breastcancer metastasis suppressor1,BRMS1）是新发现的肿瘤转移抑制基因，同其它肿瘤转移抑制基因（Nm23,KISS1,Kail,ECadherin,MKK4,TIMPs等）一样，BRMS1并不影响原发肿瘤的生长，仅仅抑制癌细胞向远处部位转移［1］。为了进一步研究BRMS1，抑制恶性肿瘤转移的机制，我们应用RTPCR技术构建了带有BRMS1cDNA基因片段的真核表达载体PcDNA3.1/mycBRMS1。

    1  材料与方法

    1.1  材料

    1.1.1  细胞与质粒  人乳腺癌细胞株MCF7及人胚肾细胞株HEK293为军事医学院放射医学研究所惠赠，质料PcDNA3.1/mycHis(+)A购自Invitrogen公司。

    1.1.2  引物设计与合成  根据BRMS1cDNA序列，设计一对特异性引物，上游引物：5’agaaagcttccaccatgcctgtccagcc3’,含Hind Ⅲ酶切位点；下游引物：5’gccctcgagaggtccatccgattttc3’，含Xho Ⅰ酶切位点：βactin上游引物：actatgtttgagccttcaaca,下游引物：5’catctcttgctcgaagtcca3’由上海博亚生物技术公司合成。

    1.1.3  试剂  RNA提取试剂TRIZOL、SuperScriptTMⅢ Reverse Transcriptase及LipofecamineTM2000为Invitrogen产品；T4DNA连接酶购自Promega公司；限制性内切酶Hind Ⅲ,Xho Ⅰ及PyrobestTMDNA聚合酶购自TaKaRa公司；cmyc的单克隆抗体购自CLONTECH公司；HRP标记的羊抗鼠的Ig购自北京中山公司；Westernblot发光试剂盒购自PIERCE公司；质粒小量提取试剂盒购自Promega公司；琼脂糖购自Sigma公司；小牛血清购自杭州四季青公司。

    1.2  方法

    1.2.1  细胞培养  人乳腺癌细胞株MCF7在含10%小牛血清，100IU/ml的青霉素和100μg/ml的链霉素的RPMI1640培养液中，置37℃、含5%CO2的孵育箱中培养。

    1.2.2  细胞总RNA提取  取对数生长期的MCF7细胞，0.25%的胰蛋白酶消化，1000r/min离心弃上清，按照TRIZOL说明书中的操作步骤提取细胞总RNA，紫外分光光度仪下测定光密度OD260/OD280值（纯度＞1.8）及RNA含量，根据所测RNA含量稀释至2μg/ul。

    1.2.3  RTPCR反应  共分2部分进行：（1）RT反应参照Invitrogen试剂盒说明书进行。取总RNA1μl(2μg/μl)、Oliog(dT)1μl和10mM dNTP Mix 1μL 、Reverse Transcriptase 1μl (200U/μl)加灭活RNA酶三蒸水至20μl,PCR仪中37℃1h，95℃灭活5min，得到RT反应的cDNA。(2)PCR反应以提取的cDNA为模板，以BRMS1的上、下游引物进行PCR扩增。扩增条件：94℃预变性5min；然后94℃1min,50℃1min,72℃1min进行5个循环；再94℃1min,65℃1min,72℃1min进行25个循环；最后72℃延伸10min。1.2%的琼脂糖凝胶电泳分析结果。

    1.2.4  BRMS1基因的克隆与测序  将PCR扩增产物以1.2%琼脂糖凝胶电泳、胶后提纯化目标DNA后，经HindⅢ和XhoⅠ双酶切后，将酶切产物定向插入经同样双酶切的pcDNA3.1/mycHis(+)A质粒中，T4DNA连接酶于16℃连接过夜；转化感受态E.coliJM109,挑取抗氨苄青霉素的阳性菌落进行小量扩增，抽提质粒，提取后进行酶切鉴定，鉴定正确的重组质粒命名为pcDNA3.1/mycBRMS1。阳性克隆送上海申能博彩生物技术公司测序。

    1.2.5  pcDNA3.1/mycBRMS1转染HEK293细胞  将0.8μg pcDNA3.1/mycBRMS1质粒在2μl LipofecamineTM2000介导下转染接种20h，90%融合的HEK293细胞，36h后收取全细胞蛋白进行Wentern blot检测BRMS1的表达。

    1.2.6  Wenstern blot  将收集的蛋白行SDSPAGE电泳，经电转移（BioRad,80mA,3h）至硝酸纤维素膜上，用3%BSA封闭2h后，按1∶1000稀释的Myc单克隆抗体室温孵育2h，TBST洗3次后，加入HRP标记的羊抗鼠的IgG,室温50min，加入发光底物进行显色。

    2  结  果

    2.1  电泳结果  琼脂糖凝胶电泳显示RTPCR反应扩增产物与Marker相比较位于750bp,与引物设计时预测大小相一致，见图1。

    2.2  pcDNA3.1/mycBRMS1酶切鉴定  重组质粒pcDNA3.1/mycBRMS1经HindⅢ和XhoⅠ双酶切后琼脂糖凝胶电泳显示5.4kb和750bp两个片断，5.4kb的片断符合pcDNA3.1/mycHis(+)A酶切后的大小，750bp符合RTPCR反应扩增产生的BRMS1基因片断大小，酶切证实成功得到了真核表达载体pcDNA3.1/mycBRMS1。见图2。 1：DNA标记  2：pcDNA3.1/mycBRMS12.3  BRMS1基因测序  经测序证实，pcDNA3.1/mycBRMS1经HindⅢ和XhoⅠ双酶切后内插入的碱基组成与GenBank(NM015399)提供的人BRMS1 cDNA的基因片断组成相同。见图3。

   2.4  pcDNA3.1/mycBRMS1转染HEK293细胞的蛋白免疫印记结果  见图4。图4  Western blot显示myc标签蛋白1：HEK293细胞的组分2：转染pcDNA3.1/mycBRMS1的HEK293细胞的组分

    3  讨  论

    乳腺癌转移抑制基因BRMS1是Seraj等［1］利用差异显示法比较高转移乳腺癌细胞MDAMB435和11号染色体转染的MDAMB435而新发现的转移抑制基因，定位于11q13.1~q13.2，含有10个外显子，9个内含子，其编码264个氨基酸组成的蛋白质，分子量为28500，该基因具有多个磷酸化位点。BRMS1基因具有抑制肿瘤细胞的远处转移的作用，其BRMS1 mRNA表达下降或缺失可参与乳腺癌的转移过程，但并不影响原发肿瘤的生长。Cicek等［2］研究表明BRMS1转染乳腺癌细胞MDAMB231和MDAMB435后，其转移潜能降低50%~90%。Samant等［3］将BRMS1转染到高转移性乳腺癌细胞MDAMB435中，其转移潜能降低70%~90%，但对乳腺癌的生长无明显影响；同时将稳定转染BRMS1基因的乳腺癌细胞MDAMB435和MDAMB231注入到裸鼠乳腺脂肪垫下，其肺部和局域淋巴结转移与对照组相比明显减少。Saunders等［4］研究显示BRMS1基因可促使细胞间隙连接通讯恢复并增加缝隙连接蛋白Cx43的表达，降低Cx32的表达，抑制乳腺癌的转移。Samant［3］等研究发现其抑制乳腺癌侵袭转移的能力与基织金属蛋白酶MMP2和MMP9的表达无关，与纤维连接蛋白、层粘连蛋白、Ⅳ型胶原等黏附分子无关，同时也不上调Nm23、Kail1、Kiss1和Ecadherin等转移抑制基因的表达，BRMS1基因抑制肿瘤转移的机制是复杂的，非典型的。BRMS1作为转移抑制基因不仅可抑制乳腺癌细胞的转移［1］，还可以抑制恶性黑色素瘤［5］、膀胱癌［6］等细胞的转移。

    研究BRMS1基因抑制肿瘤细胞转移的分子机制及开展基因肿瘤细胞转移的研究，其关键性的物质基础是BRMS1基因真核表达载体的构建。本实验应用质粒pcDNA3.1/mycHis(+)A构建BRMS1基因真核表达载体具有以下特点：（1）从结构上看，该质粒含有SV40ori复制元件，能在宿主细胞中自主复制，携带目的基因同时扩增；（2）具有启动子SV40，可使目的基因在增殖的细胞中稳定表达；（3）具有多克隆位点（multiple cloning sites,MCS），便于目的基因插入；（4）具有可供选择的遗传标志，便于对宿主细胞进行识别和筛选。如neu基因，可用G418筛选成功转染了该载体的靶细胞；含有myc蛋白标签，可进行免疫蛋白印记，识别宿主细胞。

    参  考  文  献

    ［1］Seraj MJ,Samant RS,Verderame MF,et al.Functional evidence for a novel human breast carcinoma metastasis suppressor,BRMS1,encoded at chromosome 11q13［J］.Cancer Res,2000，60（1）：27642769.

    ［2］Cieck M,Samant RS,Kinter M,et al.Identification of metastasisassociated proteins through protein analysis of metastatic MDAMB435 and metastasissuppressed Brms1 transfectedMDAMB435 cells［J］.Clin Exp Metastasis,2004，21（2）：149157.

    ［3］Samant RS,Seraj MJ,Saunders MM,et al.Analysis of mechanisms underlying BRMS1 suppression of metastasis［J］.Clin Exp Metastasis,2000，18（8）:683693.

    ［4］Saunders MM,Seraj MJ,Li Z,et al.Breast cancer metastatic potential correlates with a breakdown in homospecific and heterospecific gap junctional intercellular communication［J］.Cancer Res,2001，61（5）：17651767.

    ［5］Shevde LA,Samant RS,Goldberg SF,et al.Suppression of human melanoma metastasis by the metastasis suppressor gene BRMS1［J］.Exp Cell Res,2002,273(2):229239.

    ［6］Seraj M J,Harding M A,Gildea J J,et al.The relationship of BRMS1 and RhoGD12 gene expression to metastatic potential in lineage related human bladder cancer cell lines［J］.Clin Exp Metastasis,2000,18(6):519525.