胶质细胞活化对慢性前列腺炎/慢性盆腔疼痛综合征(CP/CPPS)大鼠脊髓背角P物质的影响
【摘要】 目的 探讨胶质细胞活化对慢性前列腺炎/慢性盆腔疼痛综合征(chronic prostatitis/chronic pelvic pain syndromes, CP/CPPS)大鼠脊髓背角P物质的影响。方法 完全福氏佐剂和3%角叉菜胶前列腺内注射造成CP/CPPS模型，脊髓插管给药胶质细胞活化抑制剂Propentofylline干扰CP/CPPS模型大鼠，免疫组织化学方法观察正常组、疼痛模型组、药物干扰组脊髓节段(L6和S1)背角的胶质细胞的活化和P物质的定性定位，并用放射免疫的方法观察三组脊髓背角P物质的变化。结果 脊髓背角胶质细胞活化阳性细胞数疼痛组明显增加，药物干扰组明显减少；P物质主要表达于脊髓背角且疼痛模型组明显增多，药物干扰组明显减少。结论 胶质细胞活化是CP/CPPS大鼠脊髓背角P物质变化的重要原因，胶质细胞活化抑制剂的应用将是CP/CPPS的新亮点。
【关键词】 前列腺炎 疼痛 P物质 胶质细胞
Substance P of cornu dorsale medullae spinalis affected by activation of glia in rats with chronic prostatitis / chronic pelvic pain syndromes
ABSTRACT: Objective To explore the relationship between activation of glia and substance P of cornu dorsale medullae spinalis in rats with chronic prostatitis/chronic pelvic pain syndromes (CP/CPPS). Methods The models of CP/CPPS were induced by injection of complete Freund? s adjuvant and 3% carrageenan in prostate. Propentofylline was given with PE?10 in spinal cord of rat models. The activation of glia and substance P in the spinal cord was detected with immunohistochemistry and the change of substance P was observed by radioimmunity. Results Activation of glia was significantly increased in models and significantly reduced in interfered groups, and substance P was significantly increased in models and significantly reduced in the interfered groups. Conclusion The activation of glia in the spinal cord was one important reason of the change in substance P excreted from cornu dorsale medullae spinalis. Inhibitor of glia activation will be a new way to treat CP/CPPS.
KEY WORDS: prostatitis; pain; substance P; glia
慢性前列腺炎/慢性盆腔疼痛综合征(chronic prostatitis/chronic pelvic pain syndromes, CP/CPPS)是泌尿门诊的常见病，疼痛是患者就诊的主要原因，严重影响了患者的生活质量，所以对慢性前列腺炎患者疼痛机制的探讨尤为重要，但国内外在这方面研究并不多。P物质(substance P, SP)是中枢神经系统内疼痛的重要调质和递质，它被认为是脊髓伤害性信息的传递物质，在脊髓痛觉信息传递过程中发挥着重要的作用，而越来越多的研究发现胶质细胞，主要是星形胶质细胞和小胶质细胞，不仅仅起支持和营养作用，还参与中枢疼痛的调控，所以本实验旨在观察CP/CPPS大鼠模型中胶质细胞活化是否能致脊髓背角P物质的改变，特别是胶质细胞活化抑制剂能否减少脊髓背角P物质的释放，从而为从胶质细胞活化抑制这个角度为临床诊治CP/CPPS疼痛提供新的靶位线索。
1 材料与方法
1.1 动物分组 60只健康雄性Sprague?Dawley(SD)大鼠，体重180-220g(由第三军医大学实验动物中心提供)，随机分为正常不加任何处理的对照组(n=20)、慢性前列腺炎疼痛模型组(n=20)、脊髓插管给药干扰组(n=20)。
1.2 CP/CPPS模型的建立 周占松[1]的建模方法并加以改进。取大鼠下腹部正中直切口暴露前列腺，于前列腺右侧叶注入3%角叉菜胶30μL(Carrageenan, Sigma公司)和完全福氏佐剂30μL(complete Freund, s adjuvant, Sigma公司)，可吸收线缝合伤口，正常饲养4周备用。
1.3 脊髓插管给药 CP/CPPS疼痛模型的大鼠麻醉后暴露并切开寰枕后膜，经切口向脊髓蛛网膜下腔插入外径0.61mm、全长12cm的PE?10聚乙烯管，插入长度为6-7cm，达到腰膨大处，3周后每次经导管注入10%胶质细胞活化抑制剂Propentofylline(Sigma公司)10μL，后用10μL生理盐水冲洗，每日1次，连用1周。
1.4 SP的检测 每组10只大鼠腹腔注射过量的25g/L戊巴比妥钠麻醉，断头处死，迅速取出L6和S1段脊髓背角，置-70℃冰箱备用。用打孔法取脊髓后角，按[2]的方法进行提取并作SP的放免测定。放免试剂盒由第二军医大学提供，结果以pmol/10mg湿重组织表示。
1.5 免疫组织化学染色和胶质活化阳性细胞计数 每组10只腹腔注射过量的25g/L戊巴比妥钠麻醉，经左心室灌注250mL 0.1mol/L PBS(pH7.4)清洗，700mL 40g/L多聚甲醛PBS液(pH7.4)固定。取腰脊髓(L6?S1)组织，40g/L多聚甲醛PBS液4℃过夜后入4℃ 300g/L蔗糖直至组织沉底。横向连续冰冻切片(25μm厚)，每隔5片取1片PBS液中备用。ABC法漂染，第一抗体GFAP工作浓度为1∶500，CD11B工作浓度为1∶200，SP的工作浓度1∶500(均为chemicon公司)。切片置于一抗中4℃孵育过夜，第2天换液后，分别与二抗、三抗室温反应90min，最终DAB着色反应3-10min(二抗、三抗和DAB试剂盒均为武汉博士德公司产品)。参考Stuesse等的计数方法，在配备OlympusBX50显微镜的LEICA Q500MC图像分析系统下，每张切片在脊髓背角区域选取5个视野，在40倍镜下，对视野内小胶质活化阳性细胞计数取平均值。
1.6 统计学处理 数据均以±s表示，采用SPSS 13.0统计学软件对各组星形胶质细胞和小胶质细胞活化的阳性细胞数进行t检验，SP采用单因素方差分析进行组间均数比较。
2 结果
CP/CPPS疼痛模型组，L6?S1脊髓背角星形胶质细胞活化阳性细胞数与对照组相比均显著增加(P<0.01)，而且星形胶质细胞变大，突起增粗延长，小胶质细胞胞体变大，细胞突起变短，形态呈“丰满”状 。药物干扰组与疼痛模型组相比星形和小胶质活化阳性细胞数均显著减少(P<0.01)，而且星形胶质细胞胞体变小，突起变细变短，小胶质细胞胞体变小，突起变长。星形胶质活化阳性细胞数和小胶质活化阳性细胞数的变化见表1。CP/CPPS疼痛的大鼠SP主要表达于脊髓的背角，疼痛模型组SP的释放明显多于正常对照组(P<0.01)，药物干扰组SP的释放较疼痛模型组明显降低(P<0.01，表2)。
表1 星形胶质细胞和小胶质细胞活化的阳性细胞数的变化（略）
与对照组相比*P<0.01；与疼痛模型组比较△P<0.01
表2 大鼠脊髓背角SP的变化（略）
与对照组相比*P<0.01；与疼痛组比较△P<0.01
3 讨论
有关疼痛调控的中枢机制研究是当今神经研究领域的热点，近年对胶质细胞的深入研究表明[3?4]，其细胞膜上存在着许多离子通道、神经递质的受体，能够产生和释放神经活性物质，负责维持神经元微环境中K+的平衡，在一些慢性疼痛的形成过程中起着重要的作用。
CP/CPSS疼痛恰恰具有慢性、持续性、难治性及部位的多变性等特点，很多患者在前列腺炎症消失后，仍有疼痛症状的持续存在，并表现为对现有镇痛效果不佳。有学者认为慢性前列腺炎疼痛可能起源于单一病因，多因素参与，并最终成慢性神经病理状态[5]，这种神经病理状态很可能有脊髓胶质细胞的参与。本研究发现脊髓背角星形和小胶质细胞的活化与对照组相比均显著增加，胶质细胞活化抑制剂propentofylline脊髓给药后与疼痛模型组相比，星形和小胶质细胞的活化明显抑制，提示胶质细胞活化确实参与了前列腺炎性疼痛的过程，有可能与慢性前列腺炎疼痛的慢性持续性、难治性疼痛的特点有密切关系。
SP被认为是脊髓伤害性信息传递物质，在脊髓痛觉信息传递过程中发挥着重要的作用，其主要由背根神经节中的神经元合成，主要存在于脊髓RexedⅠ层和Ⅱ层的Aδ和C纤维上，SP转运至脊髓背角释放，激活神经激肽Ⅰ受体参与疼痛信息的传递。一般认为SP在脊髓伤害性信息的传递过程中发挥重要作用。研究表明SP与炎性疼痛、痛觉过敏、神经源性疼痛有关。我们的研究也显示CP/CPSS疼痛大鼠脊髓背角浅表层的SP明显增加，脊髓给予胶质细胞活化抑制剂后SP明显减少，说明胶质细胞活化的确参与了脊髓背角P物质分泌的调控。其机制可能是初级传入神经末梢释放的物质(SP、EAA)和神经元的疼痛物质(一氧化氮、前列腺素)激活胶质细胞[6]；反过来，激活的胶质细胞释放大量化学物质如神经递质、神经营养因子和细胞因子(谷氨酸、神经坏死因子、SP及IL?1、IL?6、肿瘤坏死因子等)，通过提高初级传入神经释放SP、兴奋性氨基酸和增加产生疼痛物质神经元的兴奋性来调节疼痛，形成正反馈回路，从而可引发瀑布式反应[7]。
所以对胶质细胞活化在CP/CPPS疼痛中的作用的研究，不但有望对CP/CPPS疼痛的诊治提供新的靶位线索，也为炎性内脏痛的发生、发展的神经病研究提供实验依据，其详细的分子机制尚有待进一步探讨。
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