HBeAg和P53突变在肝癌发生中的作用

【摘要】  目的： 探讨血清HBeAg和肝癌组织中P53突变的关系及其在肝癌发生中的作用. 方法： 应用ELISA法检测血清HBeAg，PCR结合直接测序检测P53突变. 同时分析相关临床病理因素. 结果： 在42例患者中HBeAg阳性者20例，占47.6%; P53突变25例，占59.5%; HBeAg阳性同时伴有P53突变者16例. HBeAg的表达情况与肿瘤数目（P=0.002）、分化程度（P=0.025）、复发（P=0.026）有关; P53突变与肿瘤数目（P=0.013）、包膜（P=0.046）、分化程度（P=0.013）、复发（P=0.003）有关; HBeAg阳性与P53突变有关（P=0.024）. HBeAg阳性及P53突变患者的术后复发时间较短（4.6±2.1）mo（P<0.001）. 结论： HBeAg阳性和P53突变在肝癌的发生中起重要作用，常提示预后较差. 
【关键词】  肝炎e抗原,2型；基因,P53；癌,肝细胞；预后
　　【Abstract】 AIM: To study the roles of the serum HBeAg and the P53 mutation in the development of hepatocellular carcinoma(HCC).METHODS: ELISA was applied to detect serum HBeAg and PCR and direct sequencing method were used to detect the P53 mutation.The clinicopathologic characteristics were also analyzed.RESULTS: In 42 HCC cases, 20 cases(47.6%) were serum HBeAg positive, and 25 cases(59.5%) had P53 mutation.Among them, 16 cases were overlapped. HBeAg had a significant correlation with tumor count（P=0.002）, degree of the tumor differentiation（P=0.025）and recurrence（P=0.026）. P53 mutation was also significantly correlated with tumor count（P=0.013）, capsule（P=0.046）, degree of the tumor differentiation（P=0.013）and recurrence（P=0.003）.There was a close relationship between serum HBeAg positivity and P53 mutation（P=0.024）.The recurrence time was shorter in the patients with positive HBeAg and P53 mutation ［(4.56±2.13)months, P<0.001］.CONCLUTION: Serum HBeAg and P53 mutation play important roles in the development of HCC, and they imply a poor prognosis.
　　【Keywords】  hepatitis B e antigens; genes, P53; carcinoma, hepatocellular; prognosis
　　0引言
　　根据流行病学调查发现肝细胞癌(hepatocellular carcinoma, HCC)与乙型肝炎病毒(hepatitis B virus, HBV)感染密切相关. 慢性HBV感染者中HCC发生的高危性比非HBV感染人群高约200倍［1］. 我国HCC主要发生在慢性HBV感染者，HBV感染可从无症状病毒携带发展为急性肝炎、慢性肝炎、重症肝炎、肝硬化、HCC，其临床结局与HBV在体内演变的情况和机体的免疫应答有关［1］，鉴定体内HBV的感染状况对揭示HCC的发病机制有积极意义. 近来发现HBeAg与HCC 的复发和预后相关，是一个值得深入研究的指标. 为了解HBV HBeAg在HCC发生发展中的作用机制，我们检测血清HBeAg和HCC中P53突变，并探讨相关的临床病理因素.
　　1材料和方法
　　1.1材料
　　2004/2007 HBsAg阳性HCC患者42(男38，女4)例，年龄31~72岁. 挑取手术切除肿瘤组织适量立即置入液氮，其余组织送病理检查. 肿瘤组织均经病理证实. 肿瘤组织放置-80℃冰箱备用. 同时于患者术前1 wk内常规采血3 mL离心后取血清1.5 mL用eppendorf管于-80℃冰箱保存.
　　1.2方法
　　取-80℃冰箱保存的癌组织标本约0.03 g，匀浆成细胞悬液，然后按照TIANamp Genomic DNA Kit （北京天根公司提供）的说明书提取DNA. 样品储存于-20℃. HBeAg检测采用ELISA方法，由厦门新创公司提供试剂盒，按说明书操作及判断结果. 设计引物检测P53基因第7外显子249位点. 上游引物为：5′?TCCTA GGTTG GCTCT GAC?3′，下游引物为：5′?CAAGT GGCTC CTGAC CTG?3′，全长131 bp. 由上海生工协助合成. 按照Master Mix(北京天根公司提供)说明书行PCR反应. 反应条件为：94℃ 5 min；94℃ 45 s，55℃ 30 s，72℃ 45 s, 35个循环；72℃ 5 min. 产物送上海生工协助完成纯化和测序，测序引物同PCR引物.
　　统计学处理：用SPSS 13.0统计软件包进行处理. 对计量资料用t检验，对计数资料用χ2检验（或确切概率法）分析，用Log?Rank检验进行复发时间分析.　　2结果
　　2.1HBeAg与P53基因的表达情况HBeAg阳性者20例（47.6%）; P53突变25例（59.5%，图1：G>T突变）；HBeAg阳性同时伴有P53突变者16例. HBeAg的表达与肿瘤数目（P=0.002）、分化程度（P=0.025）、复发（P=0.026）有关；P53突变与肿瘤数目（P=0.013）、包膜（完整/不完整或无）（P=0.046）、分化程度（P=0.013）、复发（P=0.003）亦有关（表1~2）. 经统计分析，HbeAg阳性16例，阴性9例，P53突变阳性16例，阴性4例，HbeAg表达与P53突变有关（P<0.05）. 表1HBeAg表达与临床病理因素分析（略）表2P53表达与临床病理因素分析（略）
　　2.2复发时间分析截止至2007?08，随访发现复发者24例，其中HBeAg阳性者15，阴性者9例，P53突变者19例，野生型者5例，HBeAg阳性及P53突变者15例. 统计发现，HBeAg阳性及P53突变者复发时间（4.6±2.1) mo，短于HBeAg阴性及P53野生者（9.3±3.4）mo，差异有统计学意义（P＜0.001）.
　　3讨论
　　慢性HBV和HCV感染是慢性肝炎为肝硬化直至最终发展为HCC的最重要因素［1］. 近来研究发现，HBeAg是HCC复发的独立风险因素和预后不良指标［2-3］. HBeAg是HBV基因组前C/C区段的mRNA表达，与HBV?DNA关系密切，HBeAg阳性者病毒复制活跃，传染性强［4］. P53是细胞生长周期中负调节因子，与细胞周期的调控、DNA修复、细胞分化、细胞凋亡等重要的生物学功能有关［5］. P53的突变在肿瘤发生中起重要作用，是HCC发生的重要基因因素. 我们发现，HCC患者中，有47.6%的HBeAg阳性，说明在HCC中活动性肝炎占有相当大的比例. 而长期的活动性肝炎的存在可能伴有活跃的肝细胞损伤/修复，同时各种炎症因子的大量存在，影响各种信号的传导甚至造成基因的突变，从而使HCC发生的机会增加［6］. 本组病例中，共有25例发生P53突变，占59.5%（25/42）. 经统计分析发现，P53的突变与HBeAg阳性相关. 提示在乙肝相关性HCC中，HBeAg的持续阳性可能是造成P53突变，进而促使HCC发生的原因. 孙惠川等［7］发现，HBeAg阳性是术后复发的高危因素. HBeAg与肿瘤数目、分化程度、复发等临床病理因素有关. 
　　
        HBeAg阳性的HCC患者术后复发率较高（75.0%，15/20），提示HBeAg阳性预后较差，与孙惠川等［7］的报道相符. 同时发现，P53突变患者与肿瘤数目、包膜（完整/不完整或无）、分化程度、复发等因素有关，术后复发也较高. 李海民等［8］应用免疫组化方法，在78例HCC中有43例P53基因染色阳性，而且表明P53基因的表达与肿瘤的病分级、临床分期、有无肝内或门静脉转移、是否乙型肝炎有关. 提示P53基因的高表达与肝细胞肝癌预后差有关. 统计发现，HBeAg阳性和P53突变同时存在时，术后中位复发时间短于HBeAg阴性及P53野生者，患者预后较差. 提示HBeAg对HCC发生发展的影响可能通过P53基因的功能异常表达来实现.
【】
  　　［1］Umemura T, Kiyosawa K. Epidemiology of hepatocellular carcinoma in Japan［J］.Hepatol Res, 2007, 37(2), 95-100.

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　　［3］Sun HC, Zhang W, Qin LX, et al. Positive serum hepatitis B e antigen is associated with higher risk of early recurrence and poorer survival in patients after curative resection of hepatitis B?related hepatocellular carcinoma ［J］. J Hepatol, 2007, 47(5):684-690.

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