家族性淀粉样多发性神经性损害转甲状腺素蛋白的化学修饰
【摘要】 目的： 建立一种分析血浆脂蛋白存有转甲状腺素（TTR）蛋白化学修饰的方法. 方法： 利用PCR方法诊断家族性多发性神经性损害（FAP）患者基因突变位点. 密度梯度超速离心法分离正常健康人和FAP患者血浆脂蛋白. 利用水晶震荡子分子之间亲和仪，分析TTR蛋白与脂蛋白之间分子亲和性. ELISA方法测定血浆脂蛋白TTR浓度. 用MALDI?TOF?MS方法比较血浆与脂蛋白含有TTR蛋白的化学修饰程度. 结果： PCR方法诊断FAP患者TTR蛋白基因突变位点.分析正常人血清TTR与脂蛋白具有亲和性；正常人血浆脂蛋白TTR蛋白含有TTR浓度与FAP患者之间无明显差别. FAP ATTR Val30Met杂合子患者血浆以及脂蛋白中含有TTR蛋白，分子质量发现4个主要TTR蛋白峰. 结论： MALDI?TOF?MS方法能够分析血浆、血浆脂蛋白中含有TTR蛋白的化学修饰.
【关键词】 脂蛋白类；转甲状腺素蛋白；淀粉样神经性病，家族性；化学修饰
【Abstract】 AIM: To establish a method for analysis of transthyretin(TTR) modification in plasma. METHODS： TTR gene mutation was identified in familial amyloidotic polyneuropathy(FAP)patients using PCR and plasma lipoprotein was isolated from both FAP Val30Met patients and healthy volunteers using density gradient centrifugation. Affinity between TTR and plasma lipoprotein was analyzed by quartz crystal microbalance(QCM). Serum TTR level was measured in both FAP patients and healthy volunteers. TTR modification ratio between serum TTR and lipoprotein TTR was calculated in FAP patients using MALDI?TOF?MS testing. RESULTS： The serum TTR had an affinity with plasma lipoprotein in healthy volunteers. And the levels of serum TTR were not significantly different between FAP patients and healthy volunteers. In both serum and lipoprotein, TTR was found to have four different types of modification in FAP Val30Met patients. CONCLUSION： MALDI?TOF?MS can be used in identifying TTR modification.
【Keywords】 lipoproteins； transthyretin； amyloid neuropathies, familial；chemical modification
0引言
转甲状腺素(transthyretin，TTR)蛋白由127个氨基酸组成，在生理条件下4个TTR蛋白单体分子结合一个T4单体分子形成聚合体，存在于血液中参与甲状腺素的转运［1］. TTR蛋白基因发生遗传性突变以及在其他因素作用下TTR蛋白聚合体不稳定，容易分离形成单体. 立体结构发生变化的TTR单体，进一步重合形成蛋白纤维沉积于全身组织、脏器的细胞间质，引起末梢神经、自主神经感觉障碍以及全身症状为特征的综合临床症状，称为家族性多发性神经性损害(familial amyloidotic polyneuropathy，FAP)［2-3］. 我们建立一种能够分析血浆、尿液、血浆脂蛋白含有TTR蛋白化学修饰的方法，为研究化学修饰与淀粉样沉积形成提供方法保障.
1材料和方法
1.1材料
健康正常人8例，FAP患者7例，符合诊断标准，经PCR确定为ATTR Val30Met遗传基因突变杂和子. 血浆脂蛋白分离试剂：（1）d=1.006: NaCl 11.4 g，EDTA·Na2 0.1 g溶于DH2O 500 mL中，然后加入1 mol/L NaOH 1 mL，最后调至1000 mL.（2）d=1.182: 上述d=1.006溶液100 mL中加入BrNa 24.98 g. （3）d=1.478: d=1.006溶液100 mL中加入BrNa 78.32 g.（4）d=1.063: d=1.006溶液和d=1.182溶液，以2∶1比例混合.（5）d=1.21: 将d=1.063溶液和d=1.487溶液以2∶1比例混合.ELISA洗净液（NaCl 8 g, KH2PO4 0.2 g, Na2HPO4·12H2O 2.89 g, Tween20 0.5 g/L, pH7.4）.标本稀释液(Na2CO3 1.59 g, NaHCO3 2.93 g)/L, pH9.7. 抗体稀释液：gelatin/洗净液.封闭液：gelatin 500 mg/标本稀释液100 mL.
1.2方法
FAP ATTR Val30Met杂合子患者7例，健康正常人8例，摄入奶酪20 g, 3 h静脉采血分离脂蛋白，血浆4 mL中加入d=1.006溶液2 mL，48 000 g离心18 h（Beckman Model L 3?5日立，东京）. 收集CM/VLDL部分. 下层与d=1.182溶液2 mL混合，上层加入d=1.063 mL，190 000 g离心20 h，收集上部LDL 3 mL. 下层加入d=1.478溶液2 mL，然后与d=1.21溶液1 mL形成层，190 000 g离心40 h，收集上层2 mL. 水晶振荡子分子之间亲和性分析仪，测定TTR与脂蛋白之间的亲和性. 分别将2 μg WT?TTR和ATTR Val30Met固定于水晶振荡子上，然后将该振荡子浸入6 mL磷酸缓冲液中pH7.4平衡后，分别将15 μL各种脂蛋白加入不同的水晶振荡子上，同时记录脂蛋白与TTR结合的速率信号［4］. TTR浓度的测定：96孔酶标反应板（Maxisorp?Nunc, Denmark），每孔加入100 μL抗血清TTR抗体（Biogenesis Ltd, 7 New Fields, England, UK）反应12 h，洗涤3次，然后加入封闭液250 μL，作用1 h. 洗涤3次，加入稀释标本100 μL，反映1 h，洗涤3次. 加入100 μL抗人血清TTR抗体（DAKO, Glostrup, Denmark）反应1 h. 洗涤后再加入 HRP标记抗体（Dako, Glostrup, Denmark）100 μL，反应1 h.最后加入基质液100 μL 10 min后，用405 nm波长进行测定（microplate reader Bio Red Model 550日立，东京）TTR蛋白浓度. 另质量分析装置测定TTR蛋白的修饰性：在标本100 μL中加入抗?人血清TTR抗体25 μL，4℃作用24 h 9000 g离心5 min沉降物，分别用生理盐水和重蒸馏水各洗涤2次，最后使TTR蛋白与相应抗体分离，提取所需TTR蛋白［5］.
2结果
2.1TTR蛋白与血浆脂蛋白分子之间亲和性健康正常人血清提取W?TTR蛋白以及血浆提取各种脂蛋白. 利用水晶震荡子分子之间亲和性分析仪测定TTR蛋白与脂蛋白之间的亲和性，TTR与CM/VLDL亲和性以及结合量最强，其次为HDL，最低为LDL（图1）.
2.2血浆脂蛋白中TTR蛋白含量利用血清W?TTR为标准，ELISA方法分别测定血浆、脂蛋白中TTR浓度. 正常人以及FAP ATTR Val30Met患者空腹以及摄入20 g奶油后，各种脂蛋白中TTR含量以CM/VLDL为高，其次为HDL，最低为LDL（图2）.
2.3FAP ATTR Val30Met患者血浆与脂蛋白间TTR蛋白的化学修饰利用抗原?
抗体免疫结合沉淀方法分离TTR蛋白，血浆TTR蛋白出现四个主要TTR蛋白高峰. 与标准蛋白Marker作参照分别为W?TTR(a) ATTR Val30Met(b); W?TTR?Cystin ATTR (a′) Val30Met?Cystin (b′); 血浆脂蛋白TTR分子质量分析结果与血浆相似，出现4个主要TTR蛋白峰值（图3）.
3讨论
利用ELISA方法证明血浆脂蛋白存有TTR蛋白；利用抗原?抗体特特异性结合原理，免疫沉淀方法提取血清、血浆脂蛋白中TTR蛋白，结合MALDI/TOF?MS方法能够测定TTR蛋白的化学修饰. MALDI?TOF?MS分析方法为在真空条件下，分子基团飞行程度与分子量相关. 该方法能够精确分析分子质量，在鉴别蛋白、多肽等大分子质量等方面已经被广泛应用相关学科的研究. TTR蛋白的化学修饰，在淀粉样沉积形成方面引起学者的关注. 利用水晶震荡子分子之间亲和性分析仪，分析血浆脂蛋白与正常血清TTR蛋白分子之间亲和性，发现TTR蛋白能够与血浆脂蛋白亲和曲线为抛物线，逐渐达到最大结合点后保持平衡. 利用ELISA法实验结果发现脂蛋白与TTR抗体免疫反应程度明显增加. ELISA方法测定健康正常人、FAP ATTR Val30Met患者，血浆脂蛋白中存有TTR蛋白浓度. 比较正常健康人组与FAP Val30Met患者组血浆脂蛋白中存有TTR蛋白含量，两组之间未发现有明显差别.
探讨加入适量特异性抗体量以及抗原抗体比例，提取抗原?抗体免疫复合物成分，经过相应方法处理，MALDI?TOF?MS分析TTR蛋白的分子质量，在血浆、血浆脂蛋白组分中均出现反应性高峰，提示该方法能够测定TTR蛋白. 同时血浆与血浆脂蛋白中TTR蛋白均出现相同分子量高峰相同，提示该方法处理能够提取纯净TTR蛋白效果良好；比较血浆与脂蛋白中TTR蛋白分子质量的变化，经结果提示TTR与cystine结合分子质量相符. 最近我们研究中心报道，淀粉样沉积阳性组织内脂蛋白水平明显增加，并且高密度脂蛋白免疫组织化学染色与淀粉样沉积完全重合［6］. 结合上述试验结果提示脂蛋白与淀粉样沉积形成可能相关.
【】
［1］Pettersson T, Ernstrom U, Griffiths W, et al. Lutein associated with a transthyretin indicates carotenoid derivation and novel multiplicity of transthyretin ligands［J］. FEBS Lett, 1995, 365:23-26.
［2］Takaoka Y, Tashiro F, Yi S, et al. Comparison of amyloid deposition in two lines of transgenic mouse that model familial amyloidotic polyneuropathy type Ⅰ［J］. Transgenic Res, 1997, 6:261-269.
［3］Ando Y, Nyhlin N, Suhr O, et al. Oxidative stress is found in amyloid deposits in systemic amyloidosis［J］. Biochem Biophys Res Commun, 1997, 232:497-502.
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［5］Ando Y, Ohlsson PI, Suhr O, et al. A new simple rapid screening method for variant transthyretin?related amyloidosis［J］. Biochem Biophys Res Commun, 1996, 228:480-483.
［6］Sun X, Ueda M, Yamashita T, et al. Lipid droplets are present in amyloid deposits in familial amyloidotic polyneuropathy［J］. Amyloid, 2006, 16:20-23.
