髓内循环破坏致骨内高压兔模型的建立及减压的影响

【摘要】  目的： 建立一种髓内循环破坏致骨内高压形成的动物模型的可靠方法并观察钻孔减压的影响. 方法： 采取兔单侧股骨髓腔内灌注骨水泥，破坏股骨髓内循环致骨内高压形成. 分别测量钻孔减压组和未钻孔减压组不同时段髓内压的改变，通过HE染色光镜、显微镜以及免疫组化等方法，观察不同时段远端关节软骨的形态和代谢改变. 结果： 破坏髓内循环后骨内高压形成，在未钻孔减压组骨内高压长时间存在，随时间推移压力呈下降趋势，但32 wk后仍高于正常，远端关节软骨出现骨性关节炎代谢表现；在钻孔减压组，一次钻孔后，骨内压就可恢复正常水平，未见关节软骨损害出现. 结论： 所建立的髓内循环破坏致骨内高压形成的动物模型可靠, 持续时间较长且远端关节软骨出现相应损害；钻孔减压对骨内高压简单有效.

【关键词】  髓内循环；骨内高压；钻孔；减压；软骨,关节；代谢

　　【Abstract】AIM: To develop a reliable method of animal modeling of high intraosseous pressure (IP) resulted from the damage of intraosseous circulation system and observe the effect of drilling decompression treatments. METHODS: The rabbit model was established by blocking  proximal and middle femoral medullary cavity of one side with PMMA to damage intramedullary blood circulation and to cause continuous high IP.  IP between drilling decompression group and undrilling decompression group was compared at different time points. HE staining, light microscope, eletron microscope and immunohistochemical method were used to observe the morphology of distal articular cartilage and its metabolism changes at different time points. RESULTS: High IP was formed after the damage of the intramedullary blood circulation and it lasted for a long time in undrilling decompression group.With time going on, the pressure showed an obvious trend of decline, but it was still higher than the normal level after a period of 32 weeks; distal articular cartilage presented osteoarthritis and metabolism. As for the drilling decompression group, the IP almost recovered to its normal level without showing damage of articular damage. CONCLUSION: A reliable animal model of high IP resulted from the damage of the intraosseous circulation system can be established successfully.High IP can last for a long time with damage of distal articular cartilage. Drilling decompression is simple and effective to treat high IP.  

　　【Keywords】intramedullary blood circulation; high intraosseous pressure; drilling; decompression; cartilage, articular; metabolism

　　0引言

　　静脉回流障碍是引起骨内压增高的主要原因，骨内循环淤滞是骨内高压的病理本质［1］. 而骨内高压的持续状态必然引起远端关节软骨的代谢改变. 软骨局部基质金属蛋白酶?1（matrix metalloproteinases?1, MMP?1）的异常增高在软骨退变中起重要作用［2］，是软骨受损的指标之一. 既往建立骨内高压动物模型采用的是肢体关节固定法、外周循环阻滞法、交叉韧带及滑膜组织切除法［3］，没有直接破坏髓内循环的方法. 我们通过骨水泥填塞造成髓内循环的破坏，建立骨髓腔内循环障碍所致的动物模型以完善骨内高压动物模型的病因种类，为进一步研究骨内高压及其对关节软骨的影响创造实验基础.

　　1材料和方法

　　1.1材料

　　新西兰大白兔54只由重庆医科大学实验动物中心提供，雌雄不拘，体质量（3.0±0.3） kg，兔龄5  mo±7 d. 随机选取6只作为正常对照，其余48只随机分成2组，每组24只. 聚甲基丙烯酸甲酯TJ骨水泥(天津市合成材料公司生产的PMMA)；16号上颌窦穿刺针（上海埃斯埃医械制品有限公司）；HU?50型智能数显测压仪（安徽赛英电子研究所提供）；重酒石酸去甲基肾上腺素注射液(上海禾丰制药有限公司)；MMP?1一抗, 购于美国Chemicon公司，二抗及配套试剂为武汉博士德生物公司产品.

　　1.2方法

　　取兔右侧股骨髓腔内骨水泥灌注填塞，左侧作为空白对照. 将48只兔以速眠新0.15 mL/kg前肢im麻醉后，俯卧位下肢外展30度固定于手术台，以兔股骨第3转子为中心，作长约3 cm的后外侧切口，沿肌间隙进入，暴露第3转子、大转子及转子间窝，在转子间窝处开髓，以探针探测髓腔方向后，再以手持式磨钻扩髓至股骨中段狭窄处，生理盐水反复冲洗，使被破坏的骨质、髓内容物完全冲出，干纱条沾干. 将PMMA骨水泥揉成直径0.4 cm圆团植入髓腔，以探针推至中段狭窄处，保留远端1/2髓腔空间. 待先前植入的骨水泥固化后，同法调配PMMA，搅拌均匀装入注射器，以长针头插入髓腔触及填塞处，抬高股骨近端，加压推注徐徐退针至骨水泥溢出，开髓创口. 将实验兔随机分成2组，分别为钻孔减压组和未钻孔减压组，每组24只；每组又分为4个不同观察时段（每时段6只动物），分别为术后4，8，16，32 wk. 手术当日从钻孔减压组中随机选取6只作为测压对象，观察压力变化，未钻孔减压组不作处理. 选取术侧家兔外侧股骨髁上1 cm处，暴露股骨远端，将测压仪与穿刺针及注满1 g/L浓度的肝素生理盐水的注射器三通相连，以穿刺针斜行向近心端与股骨长轴呈30°穿入髓腔达对侧皮质，退针少许，观察仪器显示数据，待其无明显变化后，记录所得压力值即为股骨远端髓内压. 术后当日测量完术侧骨内压后，随机选取6只家兔立即给予耳缘静脉0.1 mg/L重酒石酸去甲肾上腺素0.1 mL/kg，观察骨内压变化情况. 取不同时段的钻孔减压组与未钻孔减压组家兔股骨远端关节行HE染色光镜观察. 取各组家兔关节软骨标本行电子显微镜观察. 取各组家兔股骨远端关节标本脱钙，石蜡包埋切片，免疫组化检测MMP?1在软骨内的表达.

　　统计学处理： 实验数据以x±s表示，采用SPSS 10.0统计软件进行多样本均数比较的方差分析. P<0.05为差异有统计学意义.

　　2结果

　　2.1骨内压力的变化术后iv去甲肾上腺素后，正常组骨内压先升至（3.60±0.20） kPa, 0.5 h后降为（2.30±0.35） kPa；术侧骨内压上升为（4.67±0.49） kPa，0.5 h后下降为（4.13±0.42） kPa. 正常组中注射去甲肾上腺素后骨内压升高和降低的幅度差为（1.29±0.16） kPa，而手术组骨内压升高和降低的幅度差为（0.54±0.10） kPa，两者有统计学差异（P<0.05）. 术后当日空白对照组骨内压与未钻孔减压组之间有统计学差异（P<0.05）；术后4 wk未钻孔减压组骨内压与钻孔减压之间有统计学差异（P<0.05）；术后8 wk未钻孔减压组骨内压与钻孔减压组之间仍有统计学差异（P<0.05）；术后16 wk及32 wk未钻孔减压组和钻孔减压组之间仍有统计学差异（P<0.05）；但术后4 wk空白对照与钻孔减压组之间骨内压已无统计学差异，而未钻孔减压组的骨内压直到手术32 wk后仍高于空白对照（P<0.05，表1）. 表1术后骨内压的变化（略）
 
　　2.2股骨远端关节软骨的变化正常关节软骨与钻孔减压组各时间点均无明显差异；未钻孔减压组关节软骨4 wk未见明显改变；8 wk表浅层软骨细胞数量明显减少，中间层软骨细胞排列出现紊乱；16 wk表浅软骨细胞稀疏，中、深层软骨细胞排列明显紊乱；32 wk 软骨层明显变薄，表浅层软骨细胞消失，关节面糜烂出现. EM显示正常组与钻孔减压组各时间点相比，胶原组织及软骨细胞均无统计学差异. 而在未钻孔减压组，4 wk出现胶原纤维断裂，部分胶原纤维排列紊乱，软骨细胞无明显损害；随着时间的推移，断裂胶原纤维增多，软骨细胞出现形态不规整，胞质内有空泡形成，甚至核膜消失，细胞死亡出现；至32 wk，胶原纤维明显碎裂，排列杂乱，软骨细胞崩解(图1).

　　2.3股骨远端关节软骨MMP?1表达正常组与钻孔减压组不同时间点所取标本中MMP?1染色均为阴性；未钻孔减压组4 wk可见关节软骨表浅层软骨细胞被染为棕黄色阳性，软骨中、深层细胞无明显阳性；随造模时间的延长，软骨的中间层开始有阳性细胞出现，至32 wk，软骨全层出现大量深棕色阳性细胞（图2）.

　　A: 4 wk后软骨表浅层软骨细胞阳性，深层无明显阳性; B: 32 wk软骨全层细胞阳性.

　　3讨论

　　静脉引流障碍会导致骨内压的升高. 本实验正常组静脉注射去甲基肾上腺素后，骨内压呈现先高后低的正常双极反应，是血循环正常的表现. 其升高和降低的幅度之差为(1.29±0.16) kPa，在手术组，双极反应仍然存在，但幅度仅为(0.54±0.10) kPa，二者幅度差的比较，P<0.05，说明髓内循环破坏明显. 同时，我们发现术后家兔股骨内压立即升高，这也进一步说明了髓内循环破坏引起的静脉回流障碍完全能够导致骨内压升高，因此，破坏髓内循环致骨内高压动物模型的建立方法是成功的. 造模4 wk后骨内压达最高值，光镜下关节软骨虽无明显形态学改变，但电镜下已经出现胶原纤维的排列紊乱，随着观察时间的延长，逐渐出现胶原纤维断裂、排列紊乱及软骨细胞受损. Ⅱ型胶原是软骨细胞外基质的主要成分，MMP?1对Ⅱ型胶原有高度裂解活性，软骨基质的破坏是软骨退变的病理基础. 许多研究表明, MMP1在正常软骨中很难测到而在退变软骨中高表达［4］. 我们发现未钻孔减压组由于骨内高压持续存在，4 wk关节表浅的软骨细胞内出现棕黄色阳性结果，证明关节软骨的损害开始出现，而随时间推移，软骨组织中层至深层逐渐出现大量阳性染色的软骨细胞，软骨损害有加重趋势，导致远端骨性关节炎发生和. 这也证实通过破坏髓内循环可以导致骨内高压形成并较长时间维持，证明该方法是可靠的.

　　减压术是骨内高压的方法之一［5］. 在建立家兔的骨内高压动物模型后，经钻孔减压观察效果满意. 近年来，随着人工假体在临床的大量应用，骨水泥的使用和术中扩髓的手术操作不仅封闭了近端骨髓腔，还人为地破坏了正常的髓内循环，造成血流动力学及血液流变学异常致骨髓微循环障碍及其血液生化代谢改变，引起骨组织结构及其生物力学改变［6］，形成了骨性关节炎发生和发展的病理基础. 破坏髓内循环所致的骨内高压动物模型的建立，为临床使用人工假体及骨水泥时是否需要预防骨内高压形成做适当处理提供一定的理论依据.

【】
  　　［1］Uchio Y, Ochi M, Adachi N, et al. Intraosseous hypertension and venous congestion in osteonecrosis of knee［J］. Clin Orthop, 2001, 384(3):217-223.

　　［2］Malemud CJ, Goldberg VM.Future directions for research and treatment of osteoarthritis［J］.Front Biosci, 1999, 4:762-771.

　　［3］Batiste DL, Kirkley A, Laverty S, et al. Ex vivo characterization of articular cartilage and bone lesions in a rabbit ACL transaction model of osteoarthritis using MRI and micro?CT［J］.Osteoarthritis Cartilage, 2004, 12(12):986-996.

　　［4］Bluteau G, Conrozier T, Mathieu P, et al. Matrix metalloproteinase?1, ?3, ?13 and aggrecanase?1 and?2 are differentially expressed in experimental osteoarthritis［J］. Biochem Biophys Acta, 2001, 1526(2):147-158.

　　［5］唐毓金，陆敏安，潘生才. 钻孔减压术后骨内高压兔骨内压和骨髓血液流变学变化［J］. 临床康复，2006, 10（36）: 188-190.

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