用阿托伐他汀保护急性脑缺血大鼠脑的研究

              作者：陈凤，王江昆，王德贵，侯一平，宋焱峰

【摘要】  目的：探讨阿托伐他汀对急性脑缺血大鼠的脑保护作用. 方法：健康Wistar大鼠85只，雌雄不限,分为假手术组、手术组、阿托伐他汀组. 给药量分别为 3,8,10 mg/kg，连续灌胃14 d,于末次给药后1 h采用改良的线栓法制备大鼠大脑中动脉永久性缺血模型(pMCAO)，制模成功后8 h观测各组的神经行为变化,之后处死进行红四氮唑染色观察脑梗塞体积,HE染色观察脑组织形态结构变化，免疫组织化学方法检测CD34的表达并测量微血管计数(MVC)，同时检测血清总胆固醇含量. 结果：阿托伐他汀给药组(3 mg/kg)大鼠脑缺血损伤程度减轻(P<0.01)、梗死灶面积减少(P<0.01),CD34阳性细胞表达增高(P<0.05)，微血管计数增多(P<0.05)，血清总胆固醇含量无统计学差异(P>0.05). 结论：低剂量阿托伐他汀(3 mg/kg)对急性脑缺血大鼠即具有脑保护作用.

【关键词】  阿托伐他汀；脑缺血；药物疗法；红四氮唑；CD34；微血管计数

　　【Abstract】 AIM: To investigate the protective effects of atorvastatin on acute cerebral ischemia injury in rats. METHODS: Eighty?five healthy Wistar rats (female and male) were randomly divided into 5 groups: sham operated group, ischemic group, and atorvastatin 3, 8, 10 mg/kg groups. Rats were fed atorvastatin for 14 days successively. One hour after the last administered atorvastatin the modified way was used to prepare permanent middle cerebral artery occlusion (pMCAO) model. After 8 h of cerebral ischemia injury, the extent of neurological deficits was evaluated. The infarct area was measured by TTC staining technique. HE staining was used to observe brain tissue changes, the immunohistochemical method was used to examine CD34 expression and micro?vessel count (MVC).The blood serum total cholesterol content was also examined. RESULTS: In 3 mg/kg atorvastatin group the infarct size and neurological deficit scores distinctly decreased (P<0.01), CD34 positive cells distinctly increased (P<0.05), MCV also increased (P<0.05), but the blood serum total cholesterol content had no significant change (P>0.05). CONCLUSION: Low dose ator?vastatin has protective effects against focal cerebral ischemia in rats.

　　【Keywords】 atorvastatin; brain ischemia/cerebral; drug therapy; TTC; CD34; micro?vessel count

　　0  引言
   
　　脑血管疾病是目前严重危害人类健康的主要疾病之一，随着当今社会的老龄化，脑血管病发病率不断增高. 在联合国世界卫生组织调查的57个国家中死于脑血管病者占11.3%, 其中40个国家脑血管病占死因前三位［1］. 近年来对阿托伐他汀的非降脂作用受到关注，研究已发现中风后给予阿托伐他汀可以促进大脑的可塑性，增强神经功能的恢复，促进新生血管的生成［2］. 但术前给予阿托伐他汀是否可以预防大鼠脑缺血的发生,这一方面研究很少,本研究将探讨阿托伐他汀对大鼠脑缺血的保护作用机制.

　　1  材料和方法

　　1.1  材料  健康Wistar大鼠85只,雌雄均可,体质量280～320 g,由兰州大学实验动物中心提供; 阿托伐他汀(立普妥,大连辉瑞制药有限公司); 红四氮唑（分析纯)(天津市科密欧化学试剂开发中心); Rabbit Anti?CD34(BA0532); 即用型SABC试剂盒(SA1022?兔IgG); 二氨基联苯胺(DAB)显色试剂盒(AR1022)(武汉博士德生物工程有限公司).

　　1.2  方法

　　1.2.1  动物模型的制备  在Longa等［3］的基础上采用改良的线栓法制作大脑中动脉永久性缺血(permanent middle cerebral artery occlusion, pMCAO)模型.用35 mL/L水合氯醛(ip,10 mL/kg) 麻醉Wistar大鼠,直径为2.3 mm尼龙线,头端0.5 mm靠近火加热成光滑球形,并于距头端20 mm处标记，将其插入大脑中动脉(MCA),遇阻力而止,栓线插入深度为(18～20) mm，制成 pMCAO动物模型. 假手术组栓线插入深度为10 mm.术中室温保持在25℃,大鼠体温保持在37℃. 大鼠麻醉清醒后出现右侧Horner?s征阳性，提尾悬空时缺血组大鼠左前肢内收，腕屈曲，头向左向背方扭曲，运动中出现追尾现象(向对侧转圈),作为模型成功的标志.

　　1.2.2  动物分组  大鼠分为5组：假手术组：12只(栓线插入深度为10 mm);手术组: 16只(生理盐水2 mL/kg);阿托伐他汀组包括 3 mg/kg (n=18),8 mg/kg(n=20)和10 mg/kg (n=19)3组,阿托伐他汀组术前2 W通过灌胃给药,缺血损伤组给予生理盐水,假手术组不给药也不给生理盐水.

　　1.2.3  神经行为学评分  Longa等［3］的6级评分法进行评分：无任何神经功能缺陷为0分；对侧前肢蜷曲不能伸展评为1分;牵拉大鼠前肢,对侧肌力明显降低评为2分;动物可以向两侧转弯,但牵拉尾巴只能转向对侧评为3分;行走时自动向对侧追尾转圈评为4分.动物于缺血后8 h进行评分.

　　1.2.4  脑梗死面积的测定  参照［4］方法,用红四氮唑(TTC)进行组织染色观察.所有大鼠进行行为学评分后用100 mL/L水合氯醛麻醉,断头处死,取脑组织，-20℃冻存后行冠状切片,片厚2 mm, 置入20 g/L TTC溶液中37℃孵育120 min,然后用40 g/L甲醛缓冲液固定,24 h后拍照并输入机,用AUTO?CAD图像处理软件计算梗死面积(红色区为正常脑组织,白色区为梗死区),根据公式V=(S1+S2…Sn)L-(S1+Sn)L／2 (S梗死灶面积,L厚度)，然后计算体积/全脑体积比 ［5］.

　　1.2.5  脑组织HE染色和CD34免疫组化法  大鼠进行行为学评分后处死开颅取脑,将大脑冠状切面分为5片,片厚2 mm,取第三脑片用40 g/L甲醛固定24 h后进行石蜡包埋,切片,分别做HE染色和免疫组织化学法检测脑组织中CD34的表达.光学显微镜下观察脑组织病理改变和CD34的表达.

　　1.2.6  微血管计数(microvessel count, MVC)  被检测的内皮细胞染成棕黄色或棕褐色,其他细胞不着色,背景清晰. MVC计数参照文献［6］的方法,先在低倍光镜下观察每张切片(40倍)以确定组织内血管密度最高区即微血管最密集区作为“热点”(hot spot)进行计数. 任何染成棕黄色或棕褐色的单一内皮细胞或内皮细胞簇,只要它们和邻近的微血管或其他细胞分界清楚,就被视作为一条微血管. 不把血管腔作为确定一条微血管的必备条件,也不以红细胞的出现作为判断标准. 然后在高倍镜视野(200倍)计数5个视野,将每个视野计数的平均数作为该切片的微血管计数值(MVC值).

　　1．2．7  血清总胆固醇(STC)测量  大鼠在处死前取其血液，离心后测其血清总胆固醇含量.
   
　　统计学处理:  采用SPSS 10.0统计软件， 计量结果用x±s表示. 组间比较采用单因素方差分析(One?Way ANOVA)及LSD?t检验, P<0.05为差异有统计学意义.

　　2  结果

　　2.1  阿托伐他汀对大鼠脑缺血的影响  用药后均可缩小大鼠脑梗死范围、神经症状改善,而各组间STC无统计学差异(表1).与假手术组比较,手术组第2～4脑片梗死明显,用药组与手术组有差异,用药组之间均有差异.3 mg/kg组梗死灶面积明显减少,8 mg/kg和10 mg/kg组梗死灶面积也减少,但两者之间差别不大(图1).

　　表1  阿托伐他汀对脑缺血的影响（略）

　　aP<0.05, bP<0.01 vs手术. NSS: 神经行为学评分; STC: 血清总胆固醇; MVC:  微血管计数.

　　A：假手术组; B：手术组 ; C：3 mg/ kg ; D：8 mg/ kg ; E：10 mg/ kg.

　　图1  脑冠状切片TTC 染色(梗死区域为白色,正常组织红染)（略）

　　2．2  脑组织改变  假手术组脑组织结构完整,神经细胞膜及核仁明显,神经细胞胞体有突起伸出,间质内未见出血、坏死 (图2A).手术组梗死区间质内出现大小不等的空泡,神经细胞排列紊乱,神经元数量明显减少,细胞退行性变明显,部分神经细胞溶解,细胞核固缩、深染,细胞界限不清,形成质地疏松的筛网状病灶(图2B).用药组梗死区水肿明显减轻,胞浆及核较清晰,部分神经元有退行性变,间质有水肿,但明显轻于非用药组(图2C,D,E).而不同剂量组之间存在差异性：3 mg/kg组绝大部分神经元结构清晰,病变不太明显(图2C);8 mg/kg组神经元数量略有减少;10 mg/kg组神经元退行性变较明显,细胞周围间隙扩大,细胞水肿明显(图2E).免疫组织化学染色,脑组织CD34阳性反应物标记在血管内皮细胞，血管内皮细胞呈棕黄色,微血管呈条索状(图2A′,B′,C′,D′,E′).各组间的CD34阳性表达有差异,MVC值有统计学差异(P<0.01),用药组MVC值明显高于非用药组, 3 mg/kg组高于其它两个用药组,而后两组之间差异不是很大(表1).

　　A,A′：假手术组; B,B′：手术组; C,C′：3 mg/kg; D,D′：8 mg/kg; E,E′：10 mg/kg.

　　图2  脑组织HE染色(A,B,C,D,E)和免疫组化CD34表达(A′,B′,C′,D′,E′)  ×400（略）

　　3  讨论
   
　　本实验采用线栓法制作大鼠pMCAO模型,较好地模拟了临床缺血性脑血管病的病理过程,为正确评价药物的抗脑缺血作用及其机制提供了良好的条件.脑缺血发生以后,脑组织血供减少或中断,脑能量代谢发生障碍,导致脑细胞水肿,严重者脑细胞发生坏死.有研究发现,低计量(1～3mg/kg)阿托伐他汀作用于中风大鼠后能够促进血管内皮细胞的增殖,并增加血管的管径和密度,诱发血管发生,增强神经功能的恢复,此机制可能是逆转了血管平滑肌细胞(VSMC)增生与凋亡的不平衡状态,缓解了VSMC的凋亡 ［2］. Dulak等［7］人研究了阿托伐他汀对人内皮细胞中的几种血管原性介质的影响,发现阿托伐他汀刺激了血管紧张素?2的表达并适度增强了内皮一氧化氮合酶（eNOS）的表达,而eNOS生成的NO对脑组织不但具有保护作用,还具有包括降低血小板的聚集力、抑制白细胞的黏附、扩张血管和增加脑血流量的作用. 阿托伐他汀浓度在0.01～0.10 μmol/L时能够加速成熟内皮细胞的移行,也可以增强循环内皮祖细胞的迁移和形成血管样结构的潜能,从而促进血管新生,而高浓度（>0.1 μmol/L）阿托伐他汀对此作用不太明显.Urbich等［8］认为这种对成熟内皮细胞的剂量依赖性与磷脂酰肌醇3?激酶?AKT通路有关,此通路由位于丝氨酸1177(Ser1177)上的AKT的磷酸化和内皮NO合酶（eNOS)决定,而增强内皮AKT底物磷酸化作用和eNOS的表达可以抑制血管内皮细胞的凋亡并增加血管样结构的形成［9］.
   
　　阿托伐他汀作用于外伤性脑损伤(TBI)大鼠后,可以明显减轻神经功能的损伤,增强受损神经元的存活能力,并促进损伤区边缘和海马CA3区的新生血管发生［10］. 而作用于中风小鼠后,缺血区边缘血管内皮生长因子和脑源性神经营养因子的表达增多,血管新生指数明显增高,从而增强了神经功能的恢复［11］. CD34主要集中于血管内皮细胞膜的管腔侧,尤其是细胞膜突起部分,相邻内皮细胞膜上的CD34 常相互交错性地分布,当两相邻的内皮细胞完全发育形成紧密连接时,即停止表达CD34,成为CD34 阴性细胞,由于其在新生血管内皮中表达远大于非新生血管内皮,提示其作用可能与血管生成有关［12］. 本研究发现,大鼠在中风前持续两周服用阿托伐他汀后,与单纯缺血大鼠相比，CD34阳性细胞表达增多,血管损伤减少，所以本实验推测阿托伐他汀可能是通过促进血管新生的潜在作用来改善脑功能的恢复,也可能是通过提高脑微血管抗损伤的能力,抑制血管内皮细胞的凋亡,对急性脑缺血大鼠起到脑保护作用, 从而促进了神经功能的恢复.

【】
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