噪声暴露对豚鼠耳蜗c?fos基因表达的影响

               作者：查定军, 薛涛, 乔莉, 刘大顺, 高雪, 陈俊, 邱建华 

【摘要】  目的: 观察噪声暴露后豚鼠耳蜗c?fos基因表达的变化. 方法: 选用健康雄性白色豚鼠32只，随机分为4组，1组为正常对照组，另3组为实验组. 实验组在120 dB spL的4 kHz窄带噪声中暴露4 h, 分别测试噪声暴露后2，48, 168 h及对照组豚鼠听性脑干反应（ABR）. 用免疫组织化学染色分析c?fos基因在耳蜗的表达情况，用机图像分析系统测量耳蜗c?fos蛋白的平均吸光度值. 结果：噪声暴露后豚鼠ABR阈值及耳蜗中c?fos蛋白的平均吸光度值较正常组均增大；随着时间的延长ABR阈值及c?fos蛋白的平均吸光度值均逐渐恢复，168 h组的ABR阈值及c?fos蛋白的平均吸光度值均低于2 h组和48 h组. 结论: 噪声暴露后耳蜗c?fos基因表达增高，可能与噪声暴露后耳蜗毛细胞、螺旋神经节等结构的损伤修复有关.

【关键词】  c?fos基因；耳蜗；噪声；豚鼠

　　【Abstract】 AIM: To investigate the changes of c?fos expression in the cochlea of guinea pigs after noise exposure. METHODS: Thirty?two healthy male guinea pigs were randomly distributed into 4 groups: a normal control group, and 3 experimental groups. The experimental groups were exposed to 4 kHz narrow band noise at 120 dB spL for 4 h so as to induce the cochlea damaged animal model. Auditory brainstem response (ABR) was test before and 2, 48, 168 h after noise exposure. Immunocytochemistry  was used to detect the expression of c?fos in all cochlea. The average optical density (A) of c?fos in cochlea was measured with compu?ter image analysis system. RESULTS: The threshold of ABR and A value of c?fos in noise exposed cochlea were increased compared with the control cochlea (P<0.01),  and they were gradually reduced as the time went by. CONCLUSION: The increase of c?fos expression in cochlea after noise exposure may be attributed to the damage and recovery of hair cell and spiral ganglion neuron in the cochlea.

　　【Keywords】  c?fos; cochlea; noise; guinea pig

　　0  引言
   
　　细胞癌基因c?fos是存在于人类、豚鼠和鸟类细胞核DNA中的基因片断，是一种细胞分化的诱导因子，对细胞的生长、分化及增殖起促进作用. 应激性刺激可引起神经系统c?fos基因表达的增加，c?fos基因表达增加与继发性病理过程如细胞的损伤修复、凋亡有关［1］. 噪声刺激可引起耳蜗的损伤，导致暂时性或持久性阈移［2］. 我们通过建立噪声刺激后豚鼠耳蜗损伤模型，观察噪声刺激后豚鼠耳蜗内螺旋神经节、Corti器等结构c?fos基因表达的改变，了解噪声刺激对豚鼠耳蜗内c?fos基因表达的影响，探讨c?fos基因表达与耳蜗损伤修复的关系.

　　1  材料和方法

　　1.1  材料  选用耳廓反射灵敏的健康白色红目豚鼠32只, 体质量350～400 g，雌雄不拘，由第四军医大学实验动物中心提供. 免疫组化试剂兔抗鼠c?fos多克隆抗体（一抗）由美国Santa Cruz生物技术公司生产，IgG浓度均为100 mg/L. LSAB试剂盒由美国Sigma公司生产，内配生物素标记鼠抗兔抗体（二抗）. 过氧化物酶标记链霉亲合素（streptavidin，SA），正常猪血清. DAB显色试剂为美国进口粉剂，用蒸馏水配制过滤而成，现配现用.

　　1.2  方法

　　1.2.1  动物分组  将豚鼠随机分为4组，1组为正常对照组，另3组为实验组，每组动物8只. 实验组在准自由声场中暴露于120 dB SPL 1/3倍频程的4 kHz窄带噪声中4 h, 对照组置于安静环境中.

　　1.2.2  听阈测试  对照组、实验组动物在噪声暴露前及噪声暴露后2, 48, 168 h检测豚鼠听性脑干反应(auditory brainstem response, ABR)阈值变化用以检测各组反应阈的改变. 豚鼠用200 mL/L乌拉坦(8 mL/kg)腹腔注射进行麻醉，卧位固定. 采用银制针形电极，记录电极置于两外耳道口连线与颅内正中线交叉处皮下，电极尖深达颅骨；电极置于给声侧外耳道口后下方5 mm处皮下，刺激声为click，重复率20次/s，扫描周期为10 ms，滤波带宽100～3000 Hz，信号叠加1240次，以ABR波III反应阈为标准判断听阈. 测试每只豚鼠的两耳各波反应阈. 测试数据由测试系统自身附带的微机自动读取、存储，留备分析.

　　1.2.3  耳蜗取材与切片制备  各组动物用200 mL/L乌拉坦(8 mL/kg)腹腔注射进行麻醉，仰卧固定，开胸暴露心脏，灌流冲洗，随后灌注40 g/L多聚甲醛缓冲液500 mL. 动物迅速断头处死，取出双侧听泡, 打开听泡暴露耳蜗, 挑开蜗尖及两窗膜，用4℃ 25 g/L戊二醛+10 g/L多聚甲醛行耳蜗阶内灌注固定，漂洗、过蔗糖，冰冻切片.

　　1.2.4  免疫组织化学染色  免疫组化试剂兔抗鼠c?fos多克隆抗体采用LSAB法行冰冻切片免疫组化染色，一抗工作浓度为1∶150；二抗工作浓度1∶300；DAB显色5～20 min. TBS代替一抗作为阴性对照，作免疫组化阴性对照染色.

　　1.2.5  结果观察与图像分析  在Nikon光学显微镜下观察耳蜗螺旋神经节、Corti器免疫组织化学染色结果, 通过Nikon coolpix4500数码相机摄取耳蜗螺旋神经节、Corti器免疫组织化学染色图像, 然后转存于计算机上. 用多功能真彩色病理图像分析系统, 测量耳蜗c?fos免疫阳性染色的平均吸光度蛋白免疫阳性染色的吸光度值A值.
   
　　统计学处理：用SPSS 10.0软件进行统计处理，组间比较用方差分析及LSD?t检验，P<0.05为差异有统计学意义.

　　2  结果

　　2.1  豚鼠听阈测听  以波III作为判断ABR阈值（dB SPL）的标准. 噪声暴露后2 h组（96±13）, 48 h组（87±9）, 168 h组（52±8） ABR阈值与对照组（28±5）相比，差异有统计学意义（P<0.01）. 噪声暴露组中2, 48 h组与168 h组相比差异有显著统计学意义(P<0.01).

　　2.2  c?fos癌基因蛋白产物在豚鼠内耳的表达  Fos蛋白样免疫反应阳性产物定位于神经元细胞核内，为深褐色颗粒，呈圆形或卵圆形，但在核仁空泡区、胞浆和突起均无显色. 图像分析各组耳蜗不同部分的c?fos蛋白样免疫反应阳性产物的吸光度A值如表1. 结果表明，实验组豚鼠内耳的螺旋神经节细胞、Corti器内的毛细胞、支持细胞细胞核均呈Fos蛋白样免疫反应阳性；对照组部分豚鼠内耳可疑阳性. 噪声暴露后，螺旋神经节、corti器的c?fos蛋白样免疫反应阳性产物的吸光度A值均高于正常对照组. 噪声暴露后，耳蜗c?fos蛋白样免疫反应阳性产物的吸光度A值在2 h组最高，随后逐渐下降，噪声暴露后2, 48 h组，螺旋神经节、corti器的c?fos蛋白样免疫反应阳性产物的吸光度A值高于168 h组.

　　表1  噪声暴露后耳蜗c?fos蛋白样免疫反应阳性产物的A值（略）

　　bP<0.01 vs对照； dP<0.01 vs噪声暴露后168 h.

　　3  讨论
   
　　本实验结果表明，噪声暴露后豚鼠ABR阈值经历了急剧增大到部分提高恢复的过程，说明本噪声条件可使豚鼠部分的阈移恢复. 噪声暴露后豚鼠耳蜗内c?fos蛋白样免疫反应阳性产物的表达也经过一个急剧增强到逐渐减弱的过程，c?fos蛋白样免疫反应阳性产物的表达变化与听阈的变化呈现出一定程度上的相关性，这提示c?fos蛋白样免疫反应阳性产物的表达与耳蜗的损伤修复存在一定的相关性.
   
　　细胞癌c?fos基因是存在于人类、豚鼠和鸟类细胞核DNA中的基因片段，与小鼠成骨瘤病毒中分离出的转化基因（v?fos）具有同源DNA序列. c?fos基因编码55 ku的核内蛋白质，即P55 c?fos，这一因子可识别特定的DNA序列来启动细胞的增殖和分化［3］, 在胚胎的发育过程中对细胞的生长、分化及增殖起促进作用.
   
　　c?fos基因是神经细胞中最常见的快速反应基因家族中的一员，在正常情况下不易被检测，但在缺血缺氧、创伤、噪声等刺激下, c?fos基因早期表达增加，并与继发性病理过程如细胞损伤修复、凋亡有关. 有研究证实, c?fos基因的高表达与神经细胞损伤后的细胞修复、凋亡存在着密切关系［4-5］，其内在机制在于c?fos基因的表达产物c?fos蛋白由胞质转入核内，与c?jun基因的蛋白产物c?jun蛋白形成fos?jun异源二聚体，作用于DNA的特殊序列，调节相关基因的转录，发挥第三信使的作用. 而不适当的过度表达产物直接或间接地激活了细胞内的限制性核酸内切酶，干预细胞核的修复功能［6］. c?fos在分子成熟的神经系统细胞中少有表达，在缺血缺氧、创伤、噪声等刺激下,可诱导神经细胞c?fos的异常表达，故很多神经系统的研究已将该基因的表达情况作为受损神经细胞活性及反应性的标记物之一.
   
　　c?fos癌基因蛋白产物主要位于细胞核内，故免疫组化检测表现为细胞核染色. c?fos基因的表达，提示c?fos基因参与了细胞增殖控制和信号传递. 陈向东等［7］研究发现，c?fos癌基因蛋白产物在内耳上皮及螺旋神经节的分化时期有表达，而在分化期以前及胚胎第18 d以后，其在内耳上皮、螺旋神经节细胞及其神经纤维中的表达很弱，提示c?fos基因参与了内耳的形态发育过程，在此期间可能起促分化作用. Cho等［8］研究发现，过度噪声刺激后大鼠耳蜗c?fos基因的表达增加. 本研究结果显示，c?fos癌基因蛋白产物在噪声暴露后豚鼠内耳Corti器、螺旋神经节均有表达，且c?fos癌基因蛋白产物的表达变化与听阈的变化呈现出一定程度上的相关性，在c?fos癌基因蛋白产物表达较高时，ABR反应出的听阈损失较重，c?fos癌基因蛋白产物表达逐渐下降后，ABR反应出的听阈损失亦有所恢复. 说明，c?fos基因可能参与豚鼠内耳损伤修复过程. 在此过程中c?fos基因可能起传递损伤信息、促进核内DNA复制的作用，以利损伤修复的再生.
   
　　自1987年Cruz等［9］报道发现鸟类毛细胞可以再生以来，内耳毛细胞再生的问题引起了学者的关注. Forge等［10］及Warchol等［11］又发现豚鼠及人的内耳毛细胞损伤后也可以有新的再生毛细胞出现，但再生机制不明. Duckert等［12］提出， 内耳毛细胞损伤后的再生修复是胚胎期毛细胞发育过程的重复， 因而从理论上讲毛细胞发育的一些因素对毛细胞的再生过程也有一定作用， c?fos癌基因蛋白产物在耳蜗损伤修复中的表达变化特征， 提示c?fos癌基因在耳蜗毛细胞毛细胞的再生过程可能起着一定作用. 对c?fos癌基因在内耳作用的深入研究， 将有助于探明噪声损伤后耳蜗损伤修复及内耳毛细胞再生的调控机制.

【】
  　　［1］ Nagase S, Mukaida M, Miller JM, et al. Neonatal deafening causes changes in Fos protein induced by cochlear electrical stimulation［J］. J Neurocytol, 2003, 32(4):353-361.

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　　［12］ Dukert LG, Rubel CW. Ultrastructural observations on regenerations on regenerating hair cells in the chick basilar papilla ［J］. Hear Res, 1990, 48: 161-182.