一种改进的简便经济的大鼠胰腺腺泡细胞分离提纯方法

【摘要】  目的: 探索一种简单、和稳定的胰腺腺泡分离纯化的新方法，并探讨其对细胞功能的影响. 方法: 16只SD大鼠随机分成改进方法组和内灌注方法组，戊巴比妥腹腔麻醉后，其中8只按改进方法迅速切取并剪碎胰腺组织后置于新鲜配制的细胞分离液中，37℃，CO2孵箱中孵育30 min，过滤获得细胞悬液， Hanks液(不含钙离子)清洗后获得胰腺腺泡细胞，另外8只采用内灌注方法获取胰腺腺泡细胞，然后进行细胞计数、活力测定、纯化鉴定和细胞内钙离子测定. 结果: 改进方法所获得的胰腺腺泡数量［(5.0±0.7)×106］、纯度［(78±6)%］与内灌注方法所获得的胰腺腺泡数量［(4.7±0.9)×106］、纯度［(79±7)%］比较无统计学意义(P>0.05)，而细胞活力［(93±4)%］显著高于内灌注方法［(84±3)%］(P<0.05)，细胞内钙离子浓度（3.62±0.54）显著低于内灌注方法（5.31±0.37）组(P<0.05). 结论: 改进方法是一种稳定高效且对细胞活力及功能影响较小的胰腺腺泡细胞分离提纯方法.

【关键词】  胰腺/细胞学;腺泡细胞;细胞分离/方法

    0引言

    长期以来，胰腺腺泡细胞的分离、纯化都是非常棘手的难题. 从1978年Williams等创建了经典的胰腺腺泡细胞分离纯化方法［1］以来，人们从未停止对这一难题的探索和改进，采用各种办法进行改进. 这些方法虽然稳定、可靠，但实验步骤繁琐，费用昂贵，实验条件和设备要求高，甚至有些还可以影响细胞的生理状态，引起病理变化，影响实验结果的准确性，不便于推广应用. 本研究参照已有的国内外研究，对现有的胰腺腺泡细胞分离纯化方法进行改进，拟建立一种简单、经济和稳定的胰腺腺泡分离纯化的新方法.

    1材料和方法

    1.1材料健康SD大鼠16只，雌雄不拘，体质量150～200 g (西安大学医学院动物中心). I型胶原酶(Sigma)，使用时以新鲜配制的Hanks液(不含钙离子)配制0.5 g/L细胞分离液. 100 mL/L的小牛血清(四季青生物公司)DMEM组织培养液(Gibico). Fluo?3/AM（Molecular Probes Inc, USA）.

    1.2方法

    1.2.1胰腺腺泡细胞的分离、纯化大鼠16只，术前12 h禁食，不禁水. 25 g/L戊巴比妥钠按每100 g体质量0.12 mL进行腹腔内注射麻醉后，将其浸于750 mL/L乙醇中30 min消毒. 其中8只动物在无菌条件下，固定于超净工作台上，开腹后于肝脏下缘寻找十二指肠和胰腺，迅速切取胰腺约1 g (1 cm×1 cm)浸于100 mL/L小牛血清DMEM培养液中，洗净血液、去除脂肪和淋巴等组织后，将其移入盛有5 mL预热至37℃新鲜配置的细胞分离液的烧杯中，将胰腺组织剪碎为0.5~2.0 mm的小块，置于37℃， 50 mL/L CO2孵箱中孵育30 min，依次用100目筛网和200目筛网过滤得细胞悬液，Hanks液(不含钙离子)清洗两次（800 r/min，5 min），收集细胞加5 mL 100 mL/L小牛血清DMEM培养液混匀后移入培养瓶，置于37℃，50 mL/L CO2孵箱内. 另外8只动物，采用内灌注方法提取胰腺腺泡细胞培养［2］.

    1.2.2细胞计数吸取20 μL细胞悬液，加到细胞计数板上，在倒置显微镜下(20×物镜)计数细胞数. 按公式，细胞数目=(4大格细胞数之和/4)×104×细胞原液量(mL).

    1.2.3细胞活性测定(台盼蓝排斥实验)吸取2 μL细胞悬液加入4 g/L台盼蓝5 μL，混匀后在3 min内计数活细胞和死细胞数目，计算细胞活性率（细胞活性率=（细胞总数-死细胞数）/细胞总数）.

    1.2.4腺泡细胞纯化与鉴定将细胞悬液调整到1×108～1×109个/L浓度后，制备细胞涂片，分别给予HE染色和酶原颗粒的亚甲蓝染色. 方法如下:涂片用亚甲蓝溶液染色后，以0.2 moL/L醋酸盐缓冲液分色并用4 g/L钼酸胺溶液处理后观察，计算出腺泡细胞纯化率. 分别计数10个高倍视野的HE切片上的细胞数和亚甲蓝染色切片上的细胞数，计算出腺泡细胞纯化率.

    1.2.5细胞内Ca2+测定将所获得的胰腺腺泡细胞用PBS洗两遍，调整细胞密度为5×108个/L，取2 mL加入Fluo?3/AM?DMSO，使其终浓度为5 μmoL/L，混匀，置入37℃水浴箱中避光孵育30~45 min，PBS洗3遍后加1 mL PBS混匀，于流式细胞仪上检测，激发波长488 nm，随机测定单个胰腺泡细胞的荧光强度值，取10万个胰腺腺泡细胞的荧光强度值的平均值为每份标本的测定值.

    统计学处理: 数据均以x±s表示，切应用SPSS 13.0统计软件进行独立样本t检验，P<0.05有统计学意义.

    2结果

    2.1细胞计数采用改进方法平均每克大鼠胰腺组织可提取细胞数量为(5.0±0.7)×106，与内灌注方法相比较无统计学意义（P>0.05, 表1).表1不同方法分离胰腺腺泡细胞4项指标的比较

    2.2细胞活性率台盼蓝染色蓝染者为死细胞. 改进方法组活细胞率为(93±4)%，显著低于内灌注方法（P<0.05, 图1, 表1).

    A: 改良方法组; B: 内灌注方法组. 绿色箭头所示细胞为活细胞，红色箭头所示为死细胞.

    图1不同方法分离的胰腺腺泡细胞台盼蓝染色 ×20

    2.3腺泡细胞纯化率HE染色（图2A）可见胰腺腺泡细胞呈卵圆形或不规则形，核圆形偏向细胞一侧，亚甲蓝染色（图2B）后腺泡细胞内除细胞核蓝染外，酶原颗粒呈鲜蓝色而背景不着色. 本实验得到胰腺腺泡细胞的纯化率与内灌注方法得到的腺泡细胞纯化率比较无统计学意义（P>0.05, 表1）.

    2.4细胞内Ca2+的变化改良方法组胰腺腺泡细胞内Ca2+显著低于内灌注方法组(P<0.05, 表1).A:  HE染色;       B: 亚甲蓝染色.

    图2亚甲蓝法鉴定分离胰腺腺泡细胞的纯化率×40

    3讨论

    大多数胰腺细胞提取方法由于多原因所制约，而难以推广应用. 既往方法步骤过于繁琐，从时限上不利于应用于胰腺急性疾病的研究；且胶原酶用量大而花费昂贵. 人们在这方面做出大量努力，采用各种方法来减少胶原酶的用量，降低费用. 如在胰腺细胞的分离中， Amsterdam等［2］采用了将胶原酶和透明质酸酶混合溶液向胰腺实质中注射的方法， 结果大大减少了胶原酶的用量. 现在许多介绍的胰胆管内灌注法也是旨在提高胶原酶的利用效能、降低胶原酶的使用量和成本，如张桦等［3］向胰胆管内注射大量Hanks液，以机械方法分离胰腺细胞，也同样减少了胶原酶的用量. 而何忠野等［4］所采用的是向胰胆管中逆行注射大量I型胶原酶稀释液. 而这些方法在降低胰酶使用量的同时也带来了第二个问题，对胰腺腺泡细胞功能的损害. 如采用胶原酶和胰蛋白酶的混合分离液注射［5］，根据胰腺炎的胰酶消化学说，其中的胰蛋白酶可激活胰腺中多种无活性的酶原使之成为活性酶，如胰淀粉酶、胰脂肪酶等，从而势必造成程度不一的胰腺腺泡细胞的损伤；而采用胰胆管逆行注射Hanks液或胶原酶稀释液，尽管采用了“低压”、“缓慢”等原则，但通过胰胆管向大鼠胰腺中注射3~5 mL甚至多达20 mL左右的液体，其压力仍然很大，其结果类似结石梗阻，将对胰腺腺泡细胞造成损害，而有可能成为阻碍其应用于各种实验研究、尤其是急性胰腺炎细胞水平的研究.

    细胞内钙离子浓度异常升高，即钙超载，不仅是SAP发病环节之一，而且通过作用于其他环节而促进SAP的发生，是急性胰腺炎的重要早期事件［6-7］；而且我们在前期研究中也发现在重症急性胰腺炎时胰腺腺泡细胞的钙离子调节机制出现失衡，胰腺细胞内钙超载，和胰腺细胞损伤程度相关［8］. 所有我们在本研究中选择细胞内钙离子浓度作为评价胰腺腺泡细胞功能的标准.

    本研究所建立的胰腺腺泡分离纯化的方法，分离细胞总数（个/g胰腺组织）和内灌注方法相比较更为高效. 即所采用的胰腺组织更少，步骤更简洁，省时间. 同时由于采用的胰腺组织少，所以消耗的胶原酶量也更少，有效的降低了实验费用. 而且，在本研究中我们发现改良方法所获取的胰腺腺泡细胞活力显著高于内注射法，而细胞内钙离子浓度显著低于内注射法. 这说明改良方法对细胞造成的损害更小，这和本研究所采用的不经胰胆管逆行注射、快速的取材方法和较低浓度胶原酶消化等措施关系密切. 所以，由本方法所获取的胰腺腺泡细胞不仅细胞数量和纯度稳定，而且细胞损害较小，基本保持了活体组织时的功能状态. 本研究所采用的方法稳定可靠、简单，重点着眼于避免或最大程度的减少胰腺腺泡细胞的损伤，从而为胰腺炎细胞水平的研究提供了良好的平台.

【文献】
  ［1］ Williams JA, Korc M, Dormer RL. Action of secretagogues on a new preparation of functionally intact, isolated pancreatic acini［J］. Am J Physiol, 1978, 235:517-524.

［2］ Amsterdam A, Jamieson JD. Structural and functional characterization of isolated pancreatic exocrine cells ［J］. Proc Nat Acad Sci USA, 1972, 69(10):3028-3032.

［3］ 张桦，蔡德鸿，徐春生，等. 一种简易高效的大鼠胰岛分离纯化方法［J］. 第一军医大学学报, 2001, 21(2):119-121.

［4］ 何忠野, 郭仁宣. 一种简易经济的大鼠胰腺腺泡细胞分离提纯方法［J］. 普通外科杂志, 2006,15(11):866-868.

［5］ 司徒镇强, 吴军正. 细胞培养［M］. 北京: 世界图书出版公司北京公司, 2004: 100-103.

［6］ 李永渝，张红. 胰腺腺泡钙超载与急性胰腺炎［J］. 中国中西医结合外科杂志, 2001, 7(2):123-125.

［7］ Pandol SJ. Acute pancreatitis［J］. Curr Opin Gastroententernl, 2005, 21(5):538-543.

［8］ 王连才,马清涌,沙焕臣,等. 白藜芦醇对重症急性胰腺炎钙离子调节失衡的影响［J］. 中华普通外科杂志, 2005, 20(12): 809-810.