miz1基因siRNA表达载体的构建及影响HeLa细胞对阿霉素的敏感性

             作者：刘学武,沈岚,张健,刘新平 

【摘要】  目的：构建针对转录因子miz1基因的siRNA表达载体，观察其影响HeLa细胞对阿霉素的敏感性. 方法：设计并合成针对miz1基因的siRNA寡核苷酸，克隆入siRNA表达载体,脂质体瞬时转染入HeLa细胞中,用RT?PCR检测miz1基因的mRNA表达水平,用 Western Blot检测Miz1蛋白表达水平，用MTT法检测HeLa细胞活力. 结果：DNA测序和酶切鉴定证明针对miz1基因的siRNA表达载体构建成功，RT?PCR和Western Blot表明其能降低miz1基因的mRNA表达和蛋白表达. 与对照组相比，转染上述干扰载体后的HeLa细胞，在加入阿霉素12 h后,细胞活力明显降低（P<0.05），并且干扰质粒与阿霉素存在交互作用（P<0.05），以加入阿霉素12 h和24 h后最明显. 结论：针对miz1基因的siRNA能够抑制人宫颈癌细胞系HeLa中miz1基因的表达并能增强HeLa细胞对阿霉素的敏感性.

【关键词】  转录因子Miz1；RNA干涉；转染；阿霉素

      0引言

    化疗是肿瘤的常规手段，拓扑异构酶Ⅱ抑制剂阿霉素作为常用的化疗药物之一，其能引起DNA断裂，诱导细胞凋亡，并且这一作用与靶细胞内某些基因如c?myc的表达水平密切相关. Miz1为Myc相互作用的锌指蛋白，属于POZ?ZF转录因子家族成员［1］. 目前发现Miz1能调节细胞的增殖和分化［2］，并与细胞凋亡密切相关［3］. 在辐射引起细胞DNA损伤时，Miz1的敲弱可使细胞从G1期阻滞走向凋亡［4］，当阿霉素引起DNA损伤并诱导细胞凋亡时，Miz1的表达异常可能会影响阿霉素对靶细胞的杀伤效果. 为探讨Miz1的表达与肿瘤细胞对阿霉素敏感性的关系，我们采用RNAi技术，构建了针对Miz1的siRNA的表达载体转染入人宫颈癌细胞系HeLa, 通过半定量RT?PCR以及免疫印迹检测内源性Miz1的表达并采用MTT法检测HeLa细胞的活力，为进一步研究Miz1影响肿瘤细胞对阿霉素的敏感性机制提供依据.

    1材料和方法

    1.1材料pSilencerTM 3.1?H1 neo载体（美国Ambion公司）；RNA反转录试剂(美国Promega公司)；各种限制性内切酶，T4 DNA连接酶和PCR试剂（美国Gibco公司）；DNA提取及回收试剂盒（上海华舜公司）；LipofectamineTM 2000（美国Invitrogen公司）；Odyssey红外荧光扫描成像系统（美国LI?COR公司）；大肠杆菌DH5α菌种，人宫颈癌细胞系HeLa（第四军医大学生物化学与分子生物学教研室保存）；寡核苷酸片段（上海基康生物技术有限公司合成）；抗Miz1抗体（美国Santa Cruz公司）；IRDyeTM 800红外荧光标记的羊抗兔二抗（美国Rockland公司）.

    1.2方法

    1.2.1pSilencerTM 3.1?H1 neo?miz1基因载体的构建针对转录因子miz1基因的编码区选取19个核苷酸作为siRNA作用靶点,设计并合成两条寡核苷酸片段，5′?GATCCCGCCTTACCTGTGTGATAAGTTCAA GAGACTTATCACACAGGTAAGGCTTTTTTGGAAA?3′及5′?AGCTTTTCCAAAAAAGCCTTACCTGTGTGATAAGTCTCTTGAACTTATCACACAGGTAAGGCGG?3′，其中GATCC为BamHⅠ酶切位点，AGCTT为HindⅢ酶切位点, GCCTTACCTGTGTGATAAG为设计的siRNA 序列，TTCAAGAGA转录后形成发夹环. 将上述两条寡核苷酸片段分别溶于双蒸水中至终浓度为50 pmol/L. 30 μL退火体系中加入：10×退火缓冲液3 μL，两种寡核苷酸片段各13.5 μL. 加热至95℃，于37℃恒温孵箱内放置2 h. 退火产物与线性化的pSilencerTM 3.1?H1 neo载体连接，之后转化大肠杆菌DH5α，提取质粒，选取载体中的EcoRI酶切位点和克隆片断中的HindⅢ酶切位点进行双酶切，鉴定片段是否插入目的载体中，选取阳性克隆由上海生工生物工程技术公司进行测序，以确定其是否为目的片段. 同时设计非特异性序列：5′?TTCTCCGAACGTGTCACGT?3′，与人类基因无同源性，可以作为阴性对照.

    1.2.2细胞转染将人宫颈癌细胞系HeLa以5×105/孔接种于6孔细胞培养板， 37℃，50 mL/L CO2培养箱培养24 h，当细胞长至80%汇合时进行转染. 转染操作方法按照LipfectamineTM 2000说明书进行，转染48 h后收取细胞样品，用于RT?PCR和蛋白印迹检测.

    1.2.3RT?PCR检测运用软件Primer Premier 5.0针对miz1基因的cDNA设计引物，其上游引物为：5′?gatgacatggtcacgctggctacc?3′，下游引物为：5′?gcatgtgcgaatccacacagccca?3′，产物为248 bp的片段. 针对gapdh的cDNA设计引物，其上游引物为：5′?gcctcaagatcatcagcaat?3′， 下游引物为：5′?aggtccaccactgacacgtt?3′，产物为307 bp的片段. 按Trizol试剂盒操作说明提取转染所得细胞的总RNA，紫外分光光度计测定总RNA浓度，取1 μg总RNA按照反转录试剂盒说明书进行反转录,并进行PCR扩增. PCR扩增反应总体积为50 μL：其中10×buffer 5 μL, 25 mmol／L MgCl2 3 μL，10 mmol／L dNTP 1 μL，Taq聚合酶1 μL，模板cDNA 2 μL，用于扩增miz1基因cDNA或gapdh基因cDNA的引物各1 μL，余下体积用无菌去离子水补足. PCR反应的参数为：94℃预变性4 min，94℃ 1 min,55℃ l min，72℃ l.5 min，共25个循环：72℃延伸5 min.  扩增结束后取PCR产物5 μL，在10 g/L琼脂糖凝胶上电泳，观察并记录结果.

    1.2.4免疫印迹检测转染后48 h收细胞并裂解细胞,取20 μg处理后的蛋白样品进行SDS?PAGE,电转移至NC膜，50 g/L脱脂奶粉封闭1 h，与1∶1000稀释后的一抗孵育1 h,TBST洗膜，然后与1∶20 000稀释后的红外荧光标记的二抗孵育1 h，TBST洗膜后, Odyssey 红外荧光扫描成像系统分析.

    1.2.5MTT法检测细胞增殖取对数生长期的HeLa细胞，于转染前1 d以5×104/孔接种于96孔板中，将重组质粒和对照质粒分别转染入细胞中，36 h后往其中一部分转染后的细胞中加入阿霉素至终浓度为2 mg/L，根据是否转染干扰质粒和是否加入阿霉素分成4组：转染干扰质粒+加阿霉素组；转染干扰质粒组和转染对照质粒+阿霉素组；转染对照质粒组. 每组设6个复孔. 继续培养0,6,12及24 h后分别加入5 g/L MTT 20 μL,37℃继续培养4 h,弃去培养基，加入150 μL DMSO，酶标仪测定各孔A492 nm吸光度值.

    统计学处理：采用SPSS 10.0统计软件进行统计分析，各时间点中各组吸光度值均以x±s表示，用析因分析对各时间内各组吸光度值进行统计分析， P<0.05为差异具有统计学意义.

    2结果

    2.1miz1基因干扰载体的构建pSilencerTM 3.1?H1 neo?miz1琼脂糖凝胶电泳图结果显示，用EcoRⅠ和HindⅢ进行双酶切，在重组载体中能观察到 160 bp的特异性片段，而在非重组载体中并未观察到特异性片段的出现，说明设计的miz1 siRNA寡核苷酸片段已成功插入载体中. 将该阳性克隆提取质粒，进行序列测定，测序结果表明插入片段与设计的寡核苷酸片段完全吻合（图1）.

    2.2miz1基因干扰载体对HeLa细胞内miz1 mRNA表达的抑制作用运用RT?PCR的方法检测miz1的mRNA的水平的结果显示，转染miz1基因干扰质粒组中miz1基因的mRNA水平明显降低，而转染对照质粒组与未转染质粒组中miz1基因mRNA的表达明显高于转染干扰质粒组（图2）.

    2.3miz1基因干扰载体对HeLa细胞内Miz1蛋白表达的抑制作用用免疫印迹检测Miz1蛋白的表达结果显示，在瞬时转染的HeLa细胞中，内源性Miz1蛋白的表达明显降低. 而对照质粒组与未转染质粒组中Miz1蛋白的表达量明显高于转染干扰质粒组（图3）.

    2.4HeLa细胞转染miz1干涉质粒后显著增强对阿霉素的敏感性运用MTT法检测HeLa细胞活力的结果显示，在加入阿霉素12 h后，不同组间细胞活力的差异具有统计学意义（P<0.05），转染Miz1干扰质粒和加阿霉素组的HeLa细胞活力明显降低，转染Miz1干扰质粒未加阿霉素组，细胞活力降低不明显，两者差异具有统计学意义（P<0.05）, 并且转染干扰质粒与阿霉素存在交互作用（P<0.05），以12 h和24 h最为明显，说明转染干扰质粒后，HeLa细胞对阿霉素的敏感性增强（图4）.

    3讨论

    RNAi已成为一种高效的实验技术，被广泛用于新基因筛选、基因功能鉴定以及基因等方面，具有非常广阔的应用前景［5］. 本实验中，我们采用的pSilencerTM 3.1?H1 neo载体的启动子H1是RNA聚合酶Ⅲ启动子［6］，构建了miz1基因的siRNA表达载体,该表达载体在人宫颈癌细胞系HeLa中能够有效降低内源性Miz1的表达，说明我们构建的干扰载体可以成功的抑制HeLa细胞中Miz1的表达，为我们研究Miz1影响肿瘤细胞对阿霉素的敏感性机制奠定了基础. 同时在实验中我们还发现，转染干扰质粒后，Miz1蛋白水平的降低要比其mRNA水平的降低更加明显，这提示我们所设计的siRNA不仅降低了miz1基因的mRNA水平，同时也能抑制miz1基因的mRNA的翻译.

    肿瘤细胞对化疗药物的敏感性将会影响到化疗药物的治疗效果. 很多因素可以影响到肿瘤细胞对化疗药物的敏感性，包括基因突变，基因扩增和表观遗传学的改变［7］. 某些基因的表达异常也会影响肿瘤细胞对化疗药物的敏感性［8］. 在本实验中，我们选择HeLa细胞，是因为HeLa细胞既为肿瘤细胞，同时又是工具细胞，转染效率高. 在实验中，我们发现，在加入阿霉素后，Miz1的表达可有效抑制的HeLa细胞，其生长受到的抑制更明显,说明Miz1被干扰降低后，HeLa细胞对阿霉素的敏感性增强,这提示Miz1的表达异常与肿瘤细胞对化疗药物的敏感性密切相关. 这为深入理解Miz1生物学功能提供了新方向，同时也为肿瘤的治疗提供了新的思路. 这一现象的具体机制有待进一步的研究阐明.

【】
  ［1］ Stead MA, Trinh CH, Garnett JA,et al.A Beta?Sheet Interaction Interface Directs the Tetramerisation of the Miz?1 POZ Domain［J］. J Mol Biol,2007,373(4):820-826.

［2］ Anneli G,Michaela F,Steffi H,et al. Myc regulates keratinocyte adhesion and differentiation via complex formation with Miz1［J］.J Cell Biol,2006,172(1):139-149.

［3］ Patel JH, McMahon SB. Targeting of Miz1 is essential for Myc?mediated apoptosis［J］. Biol Chem,2006,281(6):3283-3289.

［4］ Wanzel M, Kleine?Kohlbrecher D, Herold S,et al. Akt and 14?3?3eta regulate Miz1 to control cell?cycle arrest after DNA damage［J］. Nat Cell Biol,2005, 7(1):30-41.

［5］ Masiero M, Nardo G, Indraccolo S, et al. RNA interference: Implications for cancer treatment［J］. Mol Aspects Med, 2007, 28(1):143-166.

［6］ 黄锦,林菊生,董旭旸,等. PEG10基因siRNA真核表达载体的构建及其对肝癌HepG2细胞凋亡的影响［J］．第四军医大学学报,2007,28(3):206-209.

［7］ Trédan O, Galmarini CM, Patel K,et al.Drug resistance and the solid tumor microenvironment［J］. J Natl Cancer Inst,2007,99(19):1441-1454.

［8］ 井晓荣,刘丽,赵辉,等．Stathmin基因表达与肿瘤化疗药物敏感性的关系［J］．第四军医大学学报,2005,26(9):784-788.