大肠癌PARP与微血管形成的关系

            作者：李佳，黎明，郝兰香，王娅兰  

【摘要】  目的： 探讨大肠癌PARP与微血管形成的关系及其可能机制. 方法： 应用SP免疫组化染色观察30例大肠癌中PAR的表达和微血管密度的变化，流式细胞计数和明胶酶谱观察5?AIQ抑制CT26细胞后MMP?9阳性细胞数和活性的变化. 结果： 在PAR强表达的大肠癌中，微血管密度高，弱表达则密度低，其差异具有统计学意义(P=0.0001, P<0.01)；流式细胞计数中，与未处理组相比，用500 μmol/L 5?AIQ处理后，MMP?9阳性细胞的百分比降低；明胶酶谱显示，MMP?9的活性在500 μmol/L 5?AIQ处理组和未处理组中差异有统计学意义(P=0.0013, P<0.01). 结论： 大肠癌PARP的表达可能和微血管形成相关，PARP活性增强可能促进了肿瘤血管的形成.

【关键词】  聚（腺苷二磷酸核糖）聚合酶；微血管密度；明胶酶B；结直肠肿瘤

     0引言

    聚（腺苷二磷酸核糖）聚合酶［Poly(ADP?ribose) polymerase, PARP］, 参与聚ADP糖基化过程，对核内众多的蛋白质和酶类进行翻译后修饰，从而调节细胞内一系列的分子事件. 聚（腺苷二磷酸核糖）［Poly(ADP?ribose), PAR］是PARP的活化形式，对其抑制，可反映PARP的活性.  有［1-2］报道，在炎症反应、以及白血病、前列腺癌等多种恶性肿瘤中PARP的表达增强. 而我们先前的研究结果也提示：大肠癌PAR表达较正常组织明显增强，PARP与大肠癌转移具有相关性［3］. 亦有研究表明，通过抑制PARP能抑制人脐静脉血管内皮增殖［2］. 但PARP与肿瘤血管形成的关系，尚未见文献报道.  在炎症反应中，5?氨基异喹啉酮5?Aminoisoquinolinone, 5?AIQ）可通过抑制PARP活性，抑制细胞间黏附分子?1（intercellular adhesion molecule?1, ICAM?1）和P选择素(P?selectin)等黏附分子表达. 我们的前期研究也表明5?AIQ可抑制大肠癌HT?29细胞PARP活性［3］. 本研究观察了PAR（PARP的活化形式，其表达强弱可反映PARP活性的高低）与大肠癌微血管密度（MVD）的关系、大肠癌CT26细胞处理前后基质金属蛋白酶?9（matrix metalloproteinase?9, MMP?9）表达和活性的变化，初步探讨了PARP与肿瘤血管生成的关系及其可能的机制.

    1材料和方法

    1.1材料大肠癌标本（n=30）均取自重庆医科大学病教研室，病理学分级参照WTO大肠癌分级标准. 所有标本经40 g/L甲醛固定，石蜡包埋，5  μm连续切片. 小鼠大肠癌CT26细胞由四川大学魏于全教授惠赠. 5?AIQ由英国Bath大学Threadgill教授惠赠. 抗PAR抗体购自博士德生物工程有限公司,抗CD31抗体购自Gene Tech公司，抗MMP?9抗体购自Santa Cruz公司，SP免疫组化试剂盒、山羊抗兔IgG?FITC均购自北京中杉生物技术公司，核及胞质蛋白裂解液（NE?PERTM Nuclear and Cytoplasmic Extraction Reagents）购自Pierce公司，明胶购自Sigma公司.

    1.2方法

    1.2.1细胞培养将小鼠结肠腺癌细胞CT26置入含100 mL/L小牛血清的RPMI1640培养液，37℃, 50 mL/L CO2培养箱常规培养.

    1.2.2SP免疫组化染色操作按试剂盒说明书进行. PAR染色结果的判断参照文献［3］的方法. 染色强度：无着色为0分，淡黄色为1分，棕黄色为2分，棕褐色为3分；阳性范围：随机观察5个中倍视野(10×20)，每个视野计数100个肿瘤细胞，将各个视野中阳性细胞数的平均百分比作为该切片的阳性细胞百分比；<5％ 为0分，5％ ～25％ 为1分，26％ ～50％为2分，>50％ 为3分. 上述两项结果相加，0分为阴性(一)，1～3分为弱阳性(+)，4～5分为中等度阳性(?)，6分为强阳性(?). 以PBS代替一抗为阴性对照，已知阳性心肌切片为阳性对照. CD31染色结果判断： 细胞呈黄色或棕黄色为阳性（+）；无着色为阴性（-）. 以PBS代替一抗为阴性对照，自身大血管内皮细胞为阳性对照.

    1.2.3肿瘤微血管密度计数按照Weidner等［4］的评判标准，肿瘤内着色的毛细血管和微小血管. 凡呈现棕色单个内皮细胞或内皮细胞团均作为一个血管计数. 肿瘤内硬化区以及与肿瘤交界处软组织内的微血管不计数，有厚的平滑肌壁以及管腔直径＞8个红细胞直径的血管也排除在外. 计数方法：每张染色切片选择3个血管最多的癌间质区，在400倍视野下进行血管计数，每例标本分别计数3个视野，取其平均值.

    1.2.4流式细胞计数将处于对数生长期的CT26细胞3×107/L细胞悬液接种于100 mL培养瓶，培养24 h后实验组加入最终浓度为500 μmol/L的5?AIQ，对照组加入不含5?AIQ的等体积生理盐水. 培养20 h后分别收集对照组和5?AIQ处理组细胞,按试剂说明书进行MMP?9染色标记，流式细胞仪计数10000个细胞中MMP?9抗体标记阳性的细胞. 重复实验5次.

    1.2.5明胶酶谱取对数生长期CT26细胞以1×106/瓶接种于培养瓶中，培养过夜. 次日，无血清RPMI1640培养液培养1 h. 5?AIQ终浓度为500  μmol/L的无血清RPMI1640培养液继续培养24 h. 收集各组培养上清液，低速离心（200 g）去除细胞碎片, 同时将各瓶细胞消化，计数. 按照活细胞数取相应体积的培养上清液与样品缓冲液混合上样.  配制75 g/L分离胶及50 g/L浓缩胶，分离胶中加入终浓度为1 g/L的明胶，4℃恒温电泳，30 min. 电泳完毕后移入TritonX?100溶液中，低速摇动，漂洗，加明胶酶缓冲液（50 mmol/L Tris?HCl，10 mmol/L CaCl2，200 mmol/L NaCl，1 μmol/L ZnCl2，pH 7.5）37℃温育24 h. 考马斯兰R?250染色液中染色后脱色，至对照出现清晰负染酶带. 在凝胶成像仪下分析照相. 重复实验5次.

    　　统计学处理： 采用SAS 8.0统计软件进行spearman秩相关分析和t检验，P<0.05为差异有统计学意义.

    2结果

    2.1大肠癌PAR的表达与MVD的关系PAR阳性着色主要位于肿瘤细胞胞核，多靠近核膜，部分间质内皮细胞、炎症细胞弱阳性. 30例大肠癌组织中，阳性表达23例（图1）. 用CD31标记大肠癌血管，可见肿瘤间质内微血管的大小、形态均存在差异，部分呈单个内皮细胞或内皮细胞团，部分管腔不规则或无明显管腔（图2）. MVD在不同程度表达PAR的大肠癌中存在差异. 在PAR强表达的大肠癌中，微血管密度高(28.86±13.49)；弱表达则密度低(7.52±4.75). 差异具有统计学意义，P=0.0001.

　　2.2流式细胞计数对照组中，MMP?9阳性细胞的百分比为86.75%；用浓度为500 μmol/L的5?AIQ处理后，阳性细胞的百分比为69.33%. 5?AIQ处理组阳性细胞百分比较对照组降低（图3）.

    2.3明胶酶谱CT26细胞加入500 μmol/L的5?AIQ孵育后，其MMP?9的活性明显弱于未加药的CT26［（0.4001±0.0518） vs （0.6148±0.0847）］，差异具有统计学意义，P=0.0013.

    3讨论

    PARP广泛存在于真核细胞核内，能通过PAR化，参与细胞内一系列的分子生物事件. PAR作为PARP的产物，其合成的多少能反应PARP活性的强弱，通过检测PAR的表达可了解PARP的活性状态. PARP与多种疾病的发生有关. PARP与肿瘤的关系也逐渐被重视，［5］报道，PARP与肿瘤细胞的增殖分化有关；还有研究显示，结肠癌组织中PARP的活性明显高于正常肠黏膜［6］. 我们先前的研究结果提示，在人大肠癌组织中，PARP与大肠癌的侵袭转移有关，PARP活性增强有利于大肠癌侵袭转移，且P?Selectin和ICAM?1的表达增高也与大肠癌的侵袭转移有关. 而在肿瘤的转移过程中，血管生成是关键的一步. 那么PARP是否会影响肿瘤侵袭转移过程中血管的生成呢？目前尚未见文献报道. 5?AIQ作为一种强大的PARP抑制剂，在炎症反应中，可通过抑制PARP活性，抑制细胞ICAM?1和P?selectin等黏附分子表达，进而抑制由粘附分子介导的白细胞与血管内皮细胞间黏附. Rajesh等［2］研究发现，5?AIQ能通过对PARP的抑制，进而抑制血管内皮生长因子（vascular endothelial growth factor, VEGF）诱导的人脐静脉内皮细胞的增殖、迁移及血管形成等. 本实验首次对人大肠癌组织PAR表达与肿瘤MVD的关系进行了观察，结果显示MVD在不同程度表达PAR的大肠癌中存在差异，PAR高表达的组织中，MVD大；低表达的组织中，MVD小. 有研究表明，PARP与NF?κB存在协同激活作用［7］，且这种协同作用是通过PARP?1蛋白与NF?κB蛋白直接的相互作用而实现的. PARP的自动修饰可促进NF?κB·DNA复合物的形成，增强NF?κB转录活性［8］. 还有研究表明，NF?κB可上调ICAM?1, VEGF, MMP?2等的表达，从而促进大肠癌的转移［9-10］. Lu等［11］的研究表明，在单核细胞激活的情况下，MMP?9的生成与NF?κB途径有关. Pandey等［12］的研究结果指出，NF?κB抑制剂能抑制NF?κB调节的基因产物如MMP?9的表达，而这种抑制可能是通过对IKK的抑制实现的. 我们先前的实验已观察到［13］，大肠癌MVD与其转移有关，有淋巴结转移的大肠癌组织中MVD较无转移者高. 在对肿瘤血管生成的研究中，有实验显示，皮肤鳞癌组织中MMP?9的表达与肿瘤血管形成密切相关，MMP?9可能是皮肤鳞癌中重要的促血管因子之一［14］.      而本实验也观察到，用500 μmol/L的5?AIQ处理后，小鼠结肠腺癌CT26细胞中MMP?9的表达降低. 提示，PAR高表达可能与NF?κB依赖性的MMP?9表达增强引起的促肿瘤血管形成有关. 由此我们推测，PARP与肿瘤血管生成相关. 在大肠癌中，PARP活性增强，使NF?κB的活性增强，而受NF?κB调节的MMP?9表达也增高，从而促进了肿瘤血管的形成.

【文献】
  ［1］ Tentori L, Leonetti C, Scarsella M, et al. Inhibition of poly(ADP?ribose) polymerase prevents irinotecan?induced intestinal damage and enhances irinotecan/temozolomide efficacy against colon carcinoma ［J］. FASEB J, 2006,20(10):1709-1711.

［2］ Rajesh M, Mukhopadhyay P, Godlewski G, et al. Poly(ADP?ribose)polymerase inhibition decreases angiogenesis［J］. Biochem Biophys Res Commun, 2006,350(4):1056-1062.

［3］ 郝兰香，王娅兰，李圆圆. 大肠癌PARP表达与P?selectin和ICAM?1表达的相关性［J］. 基础医学与临床，2006,26(8):882-887.

［4］ Weidner N, Semple JP, Welch WR, et al. Tumor angiogenesis and metastasis?correlation in invasive breast carcinoma ［J］. N Engl J Med,1991,324:1.

［5］ Shiobara M, Miyazaki M, Ito H, et al. Enhanced polyadenosine diphosphate?ribosylation in cirrhotic liver and carcinoma tissues in patients with hepatocellular carcinoma［J］. J Gastroenterol Hepatol, 2001,16:338-344.

［6］ Hirai K, Ueda K, Hayaishi O. Aberration of poly(Adenosine diphosphate?ribose) metabolism in human colon adenomatous polyps and cancers［J］. Cancer Res,1983,43:3441-3446.

［7］ Martin?Oliva D, O?Valle F, Munoz?Gamez JA, et al. Crosstalk between PARP?1 and NF?kappaB modulates the promotion of skin neoplasia［J］.Oncogene, 2004, 23(31):5275-5283.

［8］ Nakajima H, Nagaso H, Kakui N, et al. Critical role of the automodification of Poly(ADP?ribose) Polymerase?1 in nuclear factor?κB?dependent gene expression in primary cultured mouse glial cells［J］. J Biol Chem, 2004,279(41):42774-42786.

［9］ Williams AC,Smartt H, H?Zadeh AM,et al. Insulin?like growth factor binding protein 3 (IGFBP?3) potentiates TRAIL?induced apoptosis of human colorectal carcinoma cells through inhibition of NF?kappaB［J］. Cell Death Differ, 2007,14(1):137-145.

［10］ Bar?Yehuda S, Madi L, Silberman D,et al. CF101, An agonist to the A3 adenosine receptor, enhances the chemotherapeutic effect of 5?Fluorouracil in a colon carcinoma murine model［J］. Neoplasia, 2005,7(1):85-90.

［11］ Lu Y, Wahl LM. Production of matrix metalloproteinase?9 by activated human monocytes involves a phosphatidylinositol?3 kinase/Akt/IKKα/NF?κB pathway［J］. J Leukoc Biol, 2005,78(1):259-265.

［12］Pandey MK, Sandur SK, Sung B, et al. Butein, a Tetrahydroxychalcone, inhibits nuclear factor (NF)?B and NF?B?regulated gene expression through direct Inhibition of IB kinase on Cysteine 179 Residue［J］. J Biol Chem, 2007,282(24):17340-17350.

［13］ Wang YL, Lin X. Cathepsin B expression and its relationship with microvessel density and biological behaviour of colorectal carcinoma［J］. Chin J Cancer Res, 2002,14(4):293-296.

［14］ 阎乎玲，贾静，刘芯. 皮肤鳞癌组织中MMP?9的表达与血管生成的关系［J］. 第四军医大学学报，2007,27(24):2248-2250.