二氢卡因酸盐对海马CA1区锥体神经元的影响

　【摘  要】  目的  观察不同剂量谷氨酸转运体GLT1抑制剂二氢卡因酸盐 (DHK) 对海马CA1区锥体神经元的影响。方法  采用四血管闭塞法（4VO）制作大鼠全脑缺血模型，右侧脑室注射DHK。脑组织切片硫堇染色法观察海马CA1区锥体神经元迟发性死亡（DND）程度，确定组织学分级（HG）。结果  对照（双蒸水）组海马CA1区未见明显的DND,不同剂量DHK引起不同程度海马CA1区的DND，且呈剂量依赖性。结论  不同剂量谷氨酸转运体GLT1抑制剂DHK引起海马CA1区锥体神经元迟发性死亡，且呈剂量依赖性。

　【关键词】  二氢卡因酸盐；海马；大鼠   

　【Abstract】  Objective  The effect of DHK, a selective inhibitor of glutamate transporter subtype GLT1,on the pyramidal neurons in the CA1 hippocampus was investigated. Methods  Global cerebral ischemic model was made by Fourvessel occlusion. DHK was administrated by injection into right lateral cerebral ventricle.The brain of the rats was sectioned and stained with thionin to show delayed neuronal death (DND) and Histological Grade (HG) in the CA1 hippocampus. Results  There was no apparent DND in control (distilled water) group. DHK of different doses caused DND of pyramidal neurons in the CA1 hippocampus, and to offter dose dependent. Conclusion  DHK caused DND of pyramidal neurons in the CA1 hippocampus in a dosedependent manner.

　【Key words】  Dihydrokainate； Hippocampus； Rat

    脑缺血时细胞外液中谷氨酸等兴奋性氨基酸浓度异常增高，这些兴奋性氨基酸与突触后膜的受体结合，引起钙、钠离子内流增多而导致钙超载，从而引起神经细胞损伤，因此将这些氨基酸称为兴奋性神经毒素［1］。降低脑缺血时细胞外液中谷氨酸的浓度，减少其与突触后膜特异性受体的结合，是防治其兴奋性毒性作用、减轻缺血时神经元损伤的重要手段。兴奋性氨基酸转运体（EAATs）是调控脑内细胞外液谷氨酸浓度的重要机制。到目前为止，发现并克隆了GLAST、GLT1、EAAC1、EAAT4和EAAT5五种高亲和性EAATs［2］。GLAST、GLT1为胶质细胞转运体， EAAC1、 EAAT4和EAAT5为神经元转运体［3］，其中GLT1在终止谷氨酸能神经传递，维持细胞外液谷氨酸浓度处于低水平，防止其兴奋性毒性作用方面发挥重要作用。本实验旨在观察不同剂量GLT1抑制剂二氢卡因酸盐(DHK)对海马CA1区锥体神经元的影响。

    1  材料与方法

    1.1  动物模型  采用四血管闭塞法制造大鼠全脑缺血模型［4］。健康雄性Wistar大鼠（280～320 g）36只，由河北医科大学实验动物中心提供。所有动物均首先进行双侧椎动脉凝闭。侧脑室注射方法：10%水合氯醛麻醉，参照脑立体定位图谱，右侧脑室注射双蒸水或GLT1特异性抑制剂DHK溶液20 μl,2 min注射完，留针2 min。

    1.2  实验分组  将凝闭双侧椎动脉2 d的动物随机分为2组：①蒸馏水组（n=6）：右侧脑室注射双蒸水溶液20 μl；②DHK组（n=30）：右侧脑室注射DHK溶液20 μl，根据DHK的剂量进一步分为10、100、200、500和1 000 nmol 5个亚组，每组6只。以上各组动物均在末次手术后7 d断头取材，行组织学观察。

    1.3  观察指标及方法  以上各组动物末次手术后7 d断头取脑，冠状切取视交叉后1～4 mm脑组织，常规脑组织切片，硫堇染色观察海马组织学改变。参照Kato［5］分级方法，将海马CA1区组织学改变分为0、1、2、3级。高倍镜下计数海马CA1区每1 mm区段内锥体细胞数目，每张切片双侧海马各计数3个区段，取平均数为神经元密度（ND）。

    1.4  数据处理  应用SPSS软件进行统计分析。

    2  结果

　蒸馏水组海马CA1区锥体细胞排列整齐，无细胞缺失，细胞形态完整，胞核饱满，核仁清晰，尼氏体丰富，见图1 A(封4)；侧脑室给予DHK可引起海马CA1区锥体神经元不同程度的迟发性死亡(DND)，且呈剂量依赖性，见图1 B、C、D、E、F(封4)和表1。 表1  DHK对海马CA1区锥体神经元的影响 *    与蒸馏水组比较，*P＜0.01

    3  讨论

　谷氨酸是人和哺乳动物中枢神经系统内含量最高的兴奋性氨基酸，参与中枢神经系统的信号传递，但其过度释放可产生严重的神经兴奋性毒性，从而引起神经元的损伤或死亡［6］。星形胶质细胞是中枢神经系统中数量最多的一种细胞，与神经元之间存在着复杂的细胞相互作用，在生理情况下，胶质细胞谷氨酸转运体担负着清除突触间隙中谷氨酸、维持谷氨酸低浓度的重要作用，如果抑制了GLT1的功能，谷氨酸向胶质细胞内的转运过程就会受到影响，引起突触间隙谷氨酸浓度异常升高，将导致神经元的损伤。本实验中我们观察了不同剂量（10、100、200、500和1 000 nmol）的GLT1抑制剂DHK对大鼠海马CA1区锥体神经元的影响，结果发现，随着DHK浓度的增大，神经元的损伤程度逐渐严重，即DHK抑制了谷氨酸转运体GLT1的功能而引起海马CA1区锥体神经元死亡，且呈剂量依赖性；当DHK达到1 000 nmol时，海马CA1区锥体神经元几乎完全死亡。

    1  Matsumoto Y,Yamamoto S,Suzuki Y,et al.Na+/H+ exchanger inhibitor, SM20220，is protective against excitotoxicity in cultured cortical neurons.Stroke,2004,35(1):185190.

    2  O'Shea RD. Roles and regulation of glutamate transporters in the central nervous system. Clin Exp Pharmacol Physiol,2002,29(11):10181023.

    3  Sullivan R,Rauen T,Fischer F,et al.Cloning,transport properties,and differential localization of two splice variants of GLT1 in the rat CNS:Implications for CNS glutamate homeostasis.Glia,2004,45(2):155169.

    4  Pulsinelli WA, Brierley JB.A new model of bilateral hemispheric ischemia in the unanesthetized rat. Stroke,1979,10(3):267272.

    5  Kato H,Liu Y,Araki T,et al.Temporal profile of the effects of pretreatment with brief cerebral ischemia insult in the gerbil: cumulative damage and protective effects. Brain Res,1991,553:238242.

    6  Real MF. Mechanism of exitotoxicity in neurologic disease.FASEB J,1992, 6(15):33383344.