内皮素1串联体的构建及其在COS?7细胞中的表达鉴定

【摘要】  目的： 克隆、表达内皮素1(endothlin1,ET1)串联体，提高ET1的免疫原性及其免疫机体后产生抗体的效价. 方法: 通过pGEX?4T?1载体对ET1的基因进行了串联，并在ET1串联基因下游引入GM?CSF基因，酶切鉴定及序列分析构建重组质粒；再将含有ET1串体与GM?CSF 的融合基因连接至真核表达载体pcDNA3.1（+）中，同样经过酶切鉴定及序列测定证实；并对构建表达载体转染COS?7细胞，应用间接免疫荧光法及ELISA检测表明目的基因在COS?7细胞中的表达情况. 结果: 正确构建了ET1重复序列4串体基因与GM?CSF 基因重组的克隆载体pGEX?ET1④?GM?CSF以及真核共表达质粒pcDNA3.1?ET1④?GM ?CSF；间接免疫荧光法及ELISA检测表明目的基因ET1和GM?CSF在COS?7细胞中都得到了表达. 结论： 内皮素1串联体的构建及其在COS?7细胞中的成功表达将对ET1的免疫学特性、核酸疫苗的研制以及相关自身疾病免疫的进一步研究奠定基础.

【关键词】  内皮素1 COS?7细胞 自体免疫

　　0引言

　　内皮素1（endothelin1,ET1）是1988年由Yanagisawa等［1-2］从培养的猪主动脉内皮细胞上清液中分离纯化出的一种小分子血管收缩肽，广泛分布于神经系统、循环系统和内分泌系统等，具有广泛的生物学活性, 作为强效的缩血管肽和血管平滑肌细胞有丝分裂原参与心肌缺血、高血压脑卒中以及肾衰等许多疾病的发病过程［3］. 本文将ET1基因串联构建ET1④串体并与GM?CSF基因融合，构建pcDNA?ET1?GM?CSF真核表达载体，并对重组质粒在COS?7细胞中的表达进行了鉴定, 旨在增加ET1的免疫原性，制备高滴度的ET1抗体；为进一步研制ET1重组DNA疫苗奠定基础.

　　1材料和方法

　　1.1材料

　　质粒pGEM?GM?CSF、真核表达载体pcDNA3.1(+)由第四军医大学石继红教授惠赠；COS?7细胞、pGEX?4T?1载体、菌株DH5α由本室保存；E. Z. N. AR  plasmid Miniprep Kit 购自Omega公司；核酸凝胶纯化试剂盒NucleoTrap R Gel Extraction Kit购自 Clontech 公司；鼠抗人ET1单抗隆抗体为Oncogene公司产品，人ET1为Sigma公司产品，荧光抗体羊抗鼠IgG?FITC购自华美公司；限制性内切酶类，DL?2000，T4 DNA连接酶购自 TaKaRa公司；丙烯酰胺，N N??甲叉双丙烯酰胺，TEMED，SDS及Agrose等购自Bio?Rad公司；Tris base为Promega公司产品；小牛血清购自Gibco公司；RPMI1640培养液为Sigma公司产品；低分子量标准蛋白质购自上海丽珠东风生物技术有限公司产品；其余均为国产分析纯试剂.

　　1.2方法

　　1.2.1ET1基因片段的合成委托北京奥科生物技术有限公司合成两端带有BamHⅠ和SalⅠ酶切位点的片段F1GATCCTGCTCCTGCTCTTCCCTGATGGATA AAGAGTGTGTCTACTTCTGCCACCTGGACATCATCTG GAGATCTTGAG(78 mer)；F2TCGACTCAAGATCTC CAGATGATGTCCAGGTGGCAGAAGTAGACACACTCT TTATCCATCAGGGAAGAGCAGGAGCAG(78 mer).

　　1.2.2合成片段F1与F2的退火F1和F2用灭菌双蒸水溶解至100 pmol/μL，取适量按常规方法沸煮3 min，降至室温.

　　1.2.3与克隆载体pGEX?4T?1的连接pGEX?4T?1经BamHⅠ和SalⅠ双酶切的回收片段与上述退火产物在T4 DNA连接酶作用下进行连接，转化感受态大肠杆菌DH5α，铺LB平板37℃孵箱中培养过夜，挑取单菌落扩大培养，提取质粒进行酶切鉴定及序列分析, 得到pGEX?ET1单体（pGEX?ET1①）.

　　1.2.4ET1基因的串联取序列正确的质粒pGEX?ET1①的菌体扩大培养，提取质粒，一份经BamHⅠ和SalⅠ双切回收小片段，另一份经BglⅡ和SalI双切回收大片段，大小片段连接即得ET1二串体（pGEX?ET1②）；同上酶切回收pGEX?ET1②的大片段和pGEX?ET1②的小片断，连接即可得到ET1④串体（pGEX?ET1④）,并进行酶切及序列分析测定.

　　1.2.5GM?CSF基因的克隆设计引物Pgf和Pgr，并引入Linker和相应酶切位点：Pgf attagatctggatccggtggttcagcacccgcccgctcgcccag(44 mer),Pgr tcctcgagtcact?cctggactggctcccag(30 mer). 以Pgf,Pgr为引物,以本实验室保存的pGEM?3zf?GM?CSF为模板进行PCR扩增，回收产物进行序列分析. 测序正确的PCR产物经BglⅡ和XhoI双酶切后回收.

　　1.2.6构建重组克隆及表达质粒回收经BglⅡ和XhoⅠ双酶切的GM?CSF产物及测序正确的用同样双酶切的pGEX?ET1④载体连接，连接产物转化感受态大肠杆菌DH5α，铺板培养，挑取单菌落扩大培养，提取质粒进行酶切鉴定及序列分析. 取测序正确的pGEX?ET1④?GM?CSF重组质粒用BamHⅠ和XhoⅠ双酶切的目的片段连接到经同样双酶切的pcDNA3.1载体中，构建重组的pcDNA3.1?ET1④?GM?CSF真核表达载体,挑取单菌落并扩增，提取质粒进一步进行酶切及序列鉴定.

　　1.2.7细胞培养COS?7细胞用含100 mL/L FCS的DMEM培养于100 mL细胞培养瓶，约75％长满时，用2.5 g/L胰酶+0.2 g/L EDTA消化，2000 r/min离心10 min，收集细胞用少量PBS液重悬，调整细胞浓度2×1010／L.