妊娠相关血浆蛋白?A在血管平滑肌细胞中表达及其细胞学功能

【摘要】  目的： 研究兔动脉粥样硬化（AS）模型中AS易损斑块培养出的血管平滑肌细胞(VSMCs)妊娠相关血浆蛋白?A (PAPP?A)的表达及其细胞学功能. 方法： 建立新西兰兔AS易损斑块模型，体外培养来源于主动脉正常组织、易损斑块组织的VSMCs. RT?PCR检测这两个不同来源VSMCs中PAPP?A的mRNA表达水平；细胞免疫组化方法检测PAPP?A的蛋白表达，并确定表达部位. 利用MTT法测定细胞生长曲线，采用划痕法检测细胞迁移能力，流式细胞仪检测细胞凋亡. 结果： 易损斑块组织的细胞PAPP?A的mRNA水平高；正常组织的VSMCs无PAPP?A的mRNA表达. 免疫组织化学结果显示PAPP?A在易损斑块平滑肌细胞为强阳性表达，主要分布于细胞的胞质，正常主动脉的VSMCs中未见PAPP?A表达. 来自易损斑块的血管平滑肌细胞生长能力强，较易迁移但易调亡. 结论： 易损斑块的血管平滑肌细胞强烈表达PAPP?A，并表现出相应的细胞学功能改变.

【关键词】  妊娠相关血浆蛋白?A 血管平滑肌细胞 易损斑块 差异表达

　　0引言

　　正常血管有完整的内皮细胞(EC)覆盖，中膜血管平滑肌细胞(VSMCs)处于静止状态，为收缩表型. 各种致病因子、感染等可以导致EC损伤，释放大量刺激因子、炎症细胞，从而使VSMCs活化，由收缩表型转变为分泌表型，并由中膜向内膜迁移并增殖，促进炎症的，最终形成动脉粥样硬化（AS），过度增生的新生内膜局部组织中金属蛋白酶被激活，可能导致急性冠脉综合症(ACS)发生［1］. 我们利用体外培养易损斑块血管组织来源的VSMCs，通过检测PAPP?A表达及VSMCs细胞生物学功能，为进一步探讨PAPP?A与AS易损斑块里激活的血管平滑肌细胞之间关系奠定实验基础.

　　1材料和方法

　　1.1材料231培养基及平滑肌细胞生长添加剂(Cascade Biologics公司)；Trizol试剂、RNA PCR Kit(AMV) Ver.3.0(TaRaKa公司)；PAPP?APCR引物由上海生工公司合成；鼠抗兔PAPP?A多克隆抗体（武汉博士德公司），免疫组化试剂盒(北京中杉金桥公司)；雄性纯种新西兰大白兔（解放军总动物所，普通级）；PCR引物经［2］及GenBank资料自行设计，由上海生工公司合成β?actin引物序列：正义：5′AACACCCCAGCCATGTACG 3′, 反义：5′ATGTCACGCACGATTTCCC 3′，产物全长为253 bp. PAPP?A引物序列为：正义：5′AACACCCCAGCCATGTACG 3′, 反义：5′AACACCCCAGCCATGTACG 3′,产物全长为519 bp. 其余实验试剂均为国产分析纯.

　　1.2方法

　　1.2.1兔主AS易损模型的建立用球囊损伤兔胸主动脉后高脂饲料喂养12 wk建立AS模型，以中华蝰蛇毒及组胺诱发血栓形成［3］.

　　1.2.2兔胸主动脉VSMCs的分离培养常规无菌操作下取易损斑块模型兔胸主动脉，取不稳定斑块(肉眼可见附壁血栓、或表面有破溃的粥样硬化斑块)及正常胸主动脉；组织块贴壁法培养于231细胞培养基中，放入37℃，50 mL/L CO2，湿度为95%～100%的孵箱内，静置培养60 h后去除组织块. 以下实验采用第2～3代细胞进行.

　　1.2.3血管平滑肌细胞的鉴定光学倒置显微镜下观察细胞形态，免疫细胞化学染色鉴定.

　　1.2.4半定量RT?PCR法检测PAPP?A的mRNA分别取以上二种到对数生长期的兔胸主动脉VSMCs，用Trizol提取细胞总RNA. 各取5 μg总RNA，按RNA PCR Kit (AMV)操作说明合成cDNA. 采用1 μL的cDNA上样量，PAPP?A与β?actin扩增的PCR反应参数为：94℃预变性5 min，进入以下30个循环：94℃变性45 s，59℃退火45 s，72℃延伸45 s；循环完毕，72℃延伸10 min.

　　1.2.5免疫组化法检测二种细胞PAPP?A的表达及表达部位按照SP法免疫试剂盒操作，一抗(鼠抗兔PAPP?A)稀释最佳度为1∶2000. 结果判断:细胞质内有棕黄色颗粒为阳性细胞.

　　1.2.6细胞体外生长实验MTT法：收集对数生长期的2组细胞，接种于24孔培养板，培养24 h. 每孔加入0.01 mmoL/L的MTT20 μL，继续孵育4 h. 加入二甲基亚砜150 μL，室温下振荡5 min，用Bio?Rad酶标仪测A570 nm值.

　　1.2.7流式细胞仪检测细胞凋亡对数生长期两组细胞用无血清培养液培养12 h后，按试剂盒说明书分别加入1×Binding Buffer 500 μL，Annexin V?FITC 5 μL和PI 5 μL，避光室温孵育5 min. 流式细胞仪在激发波长488 nm条件下检测，每次计数5000个细胞.

　　1.2.8细胞迁移在80%融合的单层细胞表面划出一无细胞的细痕，用基础培养液漂洗3次后加入无血清的培养液培养48 h，计数迁移到划痕区的细胞数，每组设3个复孔.
统计学处理：采用SPSS10.0软件进行统计分析，组间比较用LSD法.

　　2结果

　　2.1细胞培养结果鉴定光学显微镜下见原代血管平滑肌细胞形状多样，为梭形、带形、三角形或星形，可见明显“峰一谷”样生长. 抗α?肌动蛋白免疫细胞化学染色进行鉴定可见细胞质内有粗大的棕黄色颗粒，色浓染、不均匀沉着，胞核为紫蓝色，证实为分离得到的较纯的动脉血管平滑肌细胞（图1）.

　　A： 兔胸主动脉VSMCs(原代)×100； B： 兔胸主动脉VSMCs抗α?肌动蛋白免疫细胞化学染色×400； C： 兔胸主动脉VSMCs免疫细胞化学染色阴性对照×400.

　　图1兔胸主动脉易损斑块VSMCs的鉴定（略）

　　2.2RT?PCR检测PAPP?A mRNA表达水平总RNA电泳图条带灰度用gel pro软件分析显示灰度值28 s∶18 s约为2∶1，5 s较淡，提示RNA提取质量好，无明显降解. 琼脂糖凝胶电泳显示PAPP?A和β?actin，扩增片段大小分别在519 bp和253 bp（图2）. 图像灰度分析，PAPP?A与β?Actin条带灰度比值为细胞1∶1.996，细胞2∶0.

    
　　1： DNA marker； 2： 易损斑块VSMCs； 3： 正常VSMCs.

　　图2RT?PCR检测2种平滑肌细胞PAPP?A mRNA表达水平（略）

　　2.3免疫组织化学检测PAPP?A在不同培养细胞中的表达来源于不稳定斑块组织的VSMCs PAPP?A表达为强阳性（图3），细胞胞质中可见粗大的棕黄色颗粒，色浓染、不均匀沉着，胞核为紫蓝色；来源于制模新西兰白兔正常胸主动脉组织VSMCs，PAPP?A表达为阴性.

　　A： 不稳定斑块VSMCs； B： 正常VSMCs.

　　图3免疫组织化学检测PAPP?A在VSMCs的表达×400（略）

　　2.4易损斑块VSMCs的细胞生长正常VSMCs的A570 nm为0.78±0.10，易损斑块来源的VSMCs A570 nm为1.14±0.17，细胞相比(P=0.011)提示正常VSMCs的细胞增殖受到抑制.

　　2.5易损斑块VSMCs细胞凋亡生长状态良好的对数生长期两组细胞在无血清的基础培养液培养12 h处理后检测细胞凋亡情况，发现易损斑块来源的VSMCs细胞凋亡比正常VSMCs细胞增多，提示为PAPP?A.

　　2.6易损斑块VSMCs细胞迁移力易损斑块VSMCs细胞在无血清培养液培养48 h后，每平方毫米划痕区内迁移入的细胞数为（203.6±28.7）个，而正常VSMCs为（146.5±15.9）个(P=0.000)，提示易损斑块VSMCs运动能力显著地增强.

　　3讨论

　　AS易损斑块的破裂是ACS主要发病机制［4］，Bayes?Genis等［5］发现在ACS患者冠状动脉易损斑块内血管平滑肌细胞、内皮细胞、巨噬细胞中PAPP?A含量明显增加，并且在最易破裂的斑块“肩部”表达最丰富，而在稳定斑块中不表达或仅有少量的表达，认为PAPP?A在ACS机制中可能发挥了一定作用. 同时有研究证实血管平滑肌细胞在易损斑块的成因及最终破裂中扮演了十分重要的角色，因此进一步研究PAPP?A与血管平滑肌细胞之间的关系对理解ACS发生有重要意义.

　　我们的研究发现PAPP?A仅在易损斑块来源的VSMCs大量表达，两种来源的VSMCs在细胞学功能上表现出明显差异. 初步认为是易损斑块中VSMCs细胞表型发生改变，成为分泌炎性刺激因子、生长因子等的分泌型细胞. 同时PAPP?A在易损斑块中大量表达，促使局部IGF?I增加，促进单核、巨噬细胞摄取低密度脂蛋白胆固醇，合成并分泌促炎因子，增强肿瘤坏死因子(TNF?α)，白介素?1β(IL?1β)等表达［6］. Resch等［7］发现人皮成纤维细胞中，TNF?α，IL?1β等能增加PAPP?A mRNA蛋白的表达，呈时间和剂量效应关系. Cheryl A等也发现体外培养人冠状动脉血管平滑肌细胞中PAPP?A水平的增加与TNF?α和IL?1β剂量呈依赖性［8］. 因此致炎症前细胞因子与PAPP?A之间有相互促进并形成恶性循环的可能，从而最终使纤维帽变薄、易损斑块破裂. 同时本研究证实易损斑块来源的VSMCs在细胞周期中更容易调亡的特性，但其具体机制尚不清楚.

　　对ACS研究中，现多数实验均采用培养血管平滑肌细胞，通过各种细胞炎症因子刺激PAPP?A产生，然后进行药物或其它手段的干预，从而探讨PAPP?A在其中的可能发挥的作用. 本实验通过培养易损斑块VSMCs，发现PAPP?A的表达差异及其细胞学功能改变，为揭示PAPP?A在ACS的发生、及进一步干预提供了新思路.

【】
  　　［1］ Bowles DK, Wamhoff BR. Coronary smooth muscle adaptation to exercise: does it play a role in cardioprotection［J］. Acta Physiol Scand, 2003,178:117-121.

　　［2］ Chen BK, Overgaard MT, Bale LK, et al. Molecular regulation of the IGF?binding protein?4 protease system in human fibroblastsidentification of a novel inducible inhibitor［J］. Endocrinology,2002,143:1199-1205.

　　［3］ 陈文强,张运,张梅,等. 外源性人野生型p53基因转染导致兔动脉硬化斑块的不稳定性［J］. 中华医学杂志,2004,84:43-47.

　　［4］ Naghavi M, Libby P, Falk E, et al. From vulnerable plaque to vulnerable patient. A call for new definition and risk assessment strategies:partⅠ and part Ⅱ ［J］. Circulation,2003,108:1664-1778.

　　［5］ Bayes?Genis A, Conover CA, Overgaard MT, et al. Pregnancy?associated plasma protein A as a marker of acute coronary syndromes［J］. N Engl J Med，2001,345(14):1022-1029.

　　［6］ Bayes?Genis A, Conover CA, Schwartz RS, et al. The insulin?like growth factor axis:A review of atherosclerosis and restenosis［J］. Circ Res,2000,86:125-130.

　　［7］ Resch ZT, Chen BK, Bale LK, et al. Pregnancy?associated plasma protein A gene expression as a target of inflammatory cytokines［J］. Endocrinology，2004,145:1124-1129.

　　［8］ Cheryl A， Conover K, Laurie K. BaleCytokine stimulation of pregnancy?associated plasma protein A expression in human coronary artery smooth muscle cells: inhibition by resveratrol［J］. J Am Physiol Cell Physiol,2006,290:183-188.