糖尿病大鼠肠道、胰腺GLP?1受体mRNA的表达

【摘要】  目的： 研究胰高血糖素样多肽1(GLP?1)受体mRNA表达水平在大鼠肠道不同部位和胰腺分布的特点及两者间的差异. 方法： 以Wistar大鼠为对照，口服葡萄糖耐量试验确定自发性2型糖尿病模型GK大鼠已发病，采用实时定量PCR方法(SYBR Green法)检测大鼠不同肠段和胰腺的GLP?1受体mRNA表达水平. 结果： GLP?1受体mRNA表达中，正常大鼠不同肠段以空肠表达量最低，与回肠和结肠相比较差异有统计学意义(P<0.05)，回肠与结肠相比较差异无统计学意义(P>0.05). 糖尿病组大鼠空肠GLP?1受体mRNA相对表达量为0.27，而对照组大鼠空肠的相对表达量为0.59；糖尿病组大鼠结肠GLP?1受体mRNA相对表达量为0.5，对照组大鼠结肠的相对表达量为1；糖尿病组大鼠胰腺GLP?1受体mRNA相对表达量为0.37，而对照组大鼠胰腺的相对表达量为0.97，两组间空肠、结肠和胰腺GLP?1受体mRNA相对表达量差异均有统计学意义(P<0.05). 糖尿病组回肠GLP?1受体mRNA相对表达量为0.73，对照组回肠的相对表达量为0.86, 两组间差异无统计学意义(P>0.05). 结论: 糖尿病大鼠GLP?1受体mRNA相对表达量在空肠、结肠和胰腺的下调，提示空肠、结肠和胰腺GLP?1受体的表达变化可能与GK大鼠的糖尿病发生有关.

【关键词】  受体 胰高血糖素 GK大鼠 实时定量PCR

　　0引言

　　胰高血糖素样多肽1(glucagon like peptide?1，GLP?1)是体内的肠肽激素,其在调节体内葡萄糖稳态中起重要作用［1］. GLP?1受体广泛分布于胰腺、肺、脑、下丘脑、心血管系统、肾脏和胃肠道等. 目前对GLP?1受体的研究多集中在胰腺、神经和心血管系统［1-2］，而GLP?1受体在遗传性2型糖尿病GK（Goto?kakizaki）大鼠与正常大鼠肠道系统不同部位表达程度的比较还鲜见报道. 本研究采用实时定量PCR方法检测GLP?1受体mRNA在大鼠不同肠段的分布特点并比较遗传性2型糖尿病GK大鼠与正常大鼠的空肠、回肠、结肠和胰腺GLP?1受体的表达变化，探讨大鼠肠道和胰腺GLP?1受体在糖尿病时的改变.

　　1材料和方法

　　1.1材料遗传性2型糖尿病GK大鼠4只,雄性，25～30 wk龄，体质量350～450 g，同种系同周龄口服葡萄糖耐量实验正常的Wistar大鼠4只（成都莱克动物中心）；实时定量PCR试剂:总RNA提取试剂、反转录试剂、DNA处理酶，RNA酶抑制剂、实时定量PCR试剂盒（日本TAKALA公司）；胰岛素放免试剂盒（天津协和生物科技公司）. 所用引物均参照GenBank提供的序列,用Primer 510合成,由上海生物工程公司合成.

　　1.2方法

　　1.2.1实验分组遗传性2型糖尿病GK大鼠，空腹血糖高于9 mmol/L或口服葡萄糖耐量实验2 h 血糖高于13.9 mmol/L为已发病的GK大鼠，4只作为实验组；同种系同wk龄口服葡萄糖耐量实验正常的Wistar大鼠4只作为对照组.

　　1.2.2口服葡萄糖耐量实验（oral glucose tolerance test， OGTT）对照组和糖尿病组大鼠均给予500 g/L葡萄糖按2 g/kg体质量灌胃，分别于0，30，60，120和180 min. 使用强生稳步血糖仪测定尾静脉血糖值，并自大鼠尾静脉取血约250 μL，4℃，3000 g,离心10 min取血清约100 μL，置-80℃冰箱保存，待测定胰岛素.

　　1.2.3实时定量PCR组织取材大鼠在OGTT实验后，20 g/L戊巴比妥钠腹腔麻醉下(0.5 mL/kg),打开腹腔留取所需空肠、回肠、结肠和胰腺各约100 mg置冻存管中，立即放入液氮中冷却后置-80℃冰箱保存，用于实时定量PCR检测.

　　1.2.4组织总RNA提取及反转录成cDNA将约100 mg所需组织液氮中研磨后，置1 mL预冷的总RNA提取试剂中,快速彻底匀浆，室温放置5 min；12 000 g离心10 min，取上清移入另一新管；加200 mL氯仿,剧烈震荡15 s,室温放置5 min，4℃ 12 000 g离心15 min，取出上层无色的液体层移入另一新管；加入等体积异丙醇，室温放置10 min，4℃ 12 000 g离心10 min，弃上清；加入1 mL 750 mL/L乙醇混匀， 4℃ 7500 g离心5 min,弃上清,真空干燥沉淀的RNA；用无RNA酶水50 μL溶解沉淀物，取1 μL总RNA稀释100倍，用紫外分光光度计测定吸光度，A260 nm/A280 nm比值大于1.9，RNA浓度=（A260 nm-A320 nm）×稀释倍数×0.04 μg/μL，取20～50 μg RNA,用DNA处理酶处理后，再次抽提RNA；用紫外分光光度计测定吸光度A值,A260 nm/A280 nm比值大于1.9，取500 ng RNA将其反转录为cDNA. 反转录条件：37℃ 15 min,85℃ 5 s.

　　1.2.5实时定量PCR反应PCR反应体系为：模板cDNA 1 μL，2×SYBR Premix Ex Taq 12.5 μL,上下游引物各1 μL，加水至25 μL，每个样品重复3管. 所用引物设计如下:GLP?1受体(68 bp):上游:5＇?CATCCACCTGAACCTGTTTGC?3＇,下游:5＇?GGGCAGCGTCT TTGATGAAG?3＇；GAPDH(176 bp)上游: 5＇?GGATGCAGGGATGATGTTC ?3＇,下游: 5＇?TGCACCACCAACTGCTTA?3＇. 实时PCR反应在Biorad IQ5 System中95℃ 10 s，95℃ 5 s，62℃ 30 s，共45次循环. PCR产物从60℃缓慢而均匀地升温至95℃，温度每升高0.2℃机收集一次荧光值，每两次读值间隔1 s，由实时荧光定量PCR仪自动绘制扩增动力曲线熔链曲线，产物通过熔链曲线证实. 计算机分析Ct值,即每个反应管内荧光强度达到系统认为的有目的DNA合成时的循环数,以GAPDH作为内参照,计算机计算GLP?1受体mRNA的相对表达水平.

　　统计学处理：所有数据均以x±s表示，并采用SPSS11.1统计软件进行数据整理和统计，两组间比较采用两样本t检验，多组间比较采用单因素方差分析，P<0.05为差异具有统计学意义.

　　2结果

　　2.1两组大鼠OGTT血糖、胰岛素检测结果糖尿病组大鼠各时间点的血糖水平分别高于对照组大鼠,差异均有统计学意义(P<0.01)，而糖尿病组大鼠的血胰岛素水平分别于0，30和60 min低于对照组大鼠，两组间差异有统计学意义(P<0.05,表1).

　　表1大鼠OGTT血糖和胰岛素测定（略）

　　eP<0.05 vs 对照.

　　2.2实时定量PCR反应将荧光信号对扩增循环数作图，显示GLP?1受体基因和内参基因GAPDH的PCR荧光扩增曲线（图1），表明样品中双链DNA的浓度都升高到了背景荧光水平之上，并且都进入了指数扩增期. 图1 C和D分别显示了GLP?1受体和GAPDH cDNA PCR熔链曲线，荧光强度变化的拐点(熔点，Tm)处呈现一个单一的峰，这个峰所对应的扩增产物的熔链温度GLP?1受体为82℃，GAPDH为88℃，表明扩增产物为目的产物，荧光强度随温度变化的负一次倒数图中没有杂峰，也未出现主峰的异常增宽，表明实验中未出现污染，引物二聚体和假阳性现象.

　　A： GLP?1受体基因扩增曲线； B: GAPDH基因扩增曲线； C: GLP?1受体cDNA熔链曲线； D: GAPDH cDNA熔链曲线.

　　图1实时定量PCR扩增曲线和熔链曲线（略）

　　2.3GLP?1受体mRNA在正常大鼠肠段各部位间的相对表达量正常大鼠不同肠段GLP?1受体mRNA表达中，空肠相对表达量为0.26，与回肠相对表达量0.63和结肠相对表达量0.7相比较差异有统计学意义(P<0.05)，回肠与结肠GLP?1受体mRNA的表达量相比差异无统计学意义（P>0.05）.

　　2.4两组间GLP?1受体mRNA在肠段各部位和胰腺的相对表达量变化糖尿病组空肠GLP?1受体mRNA相对表达量为0.27，而对照组空肠的相对表达量为0.59，两组间差异有统计学意义(P<0.05). 糖尿病组回肠GLP?1受体mRNA相对表达量为0.73，对照组回肠的相对表达量为0.86, 两组间差异无统计学意义(P>0.05). 糖尿病组结肠GLP?1受体mRNA相对表达量为0.5，对照组结肠的相对表达量为1，两组间差异有统计学意义(P<0.05). 糖尿病组胰腺GLP?1受体mRNA相对表达量为0.37，而对照组胰腺的相对表达量为0.97，两组间差异有统计学意义(P<0.05).

　　3讨论

　　近年来，GLP?1作为肠降糖素受到关注. GLP?1能够增加胰岛素的生物合成及葡萄糖依赖性促胰岛素分泌，刺激β细胞增生和再生，抑制β细胞凋亡并抑制胰高血糖素的分泌［3］. 有90%胰腺切除大鼠胰腺的GLP?1受体表达明显低于正常大鼠，而这种表达量下调与胰腺的高糖环境相关，随着高糖环境的改善，胰腺GLP?1受体表达量能够上调至正常水平［4］，我们实验结果显示GK大鼠胰腺的GLP?1受体表达显著低于正常大鼠，差异有统计学意义(P<0.05),提示此种糖尿病大鼠模型中糖尿病的发生与可能与胰腺的GLP?1受体表达下调有关.

　　GLP?1除通过作用于胰腺来调节葡萄糖代谢，越来越多的证据表明GLP?1在胃肠道生理中发挥重要作用，其能够调节上消化道功能，减少进食诱发的胃酸分泌［5］. 大鼠GLP?1在不同肠段的表达量是不同的，以空肠表达量较低，而回、结肠表达量较高［6］， 而我们的实验显示GLP?1受体mRNA在回、结肠表达量较高、而空肠的表达量较低，提示GLP?1受体表达量可能与GLP?1表达量是成正相关的. 虽然肠道中GLP?1受体mRNA在空肠表达量最低，但在糖尿病GK大鼠空肠中GLP?1受体mRNA表达量显著低于对照组. 有研究［7］表明GLP?1能够减少大鼠小肠淋巴回流、甘油三酯的吸收以及载脂蛋白的形成，改善糖尿病患者餐后高甘油三酯血症，并降低游离脂肪酸水平［8］，提示空肠作为主要的营养物质吸收器官，其在调节代谢中所发挥的作用不应忽视. 在GLP?1受体mRNA表达量较高的回肠和结肠中，糖尿病GK大鼠结肠GLP?1受体mRNA表达较对照组相比显著降低，而在回肠其差异无统计学意义，提示结肠GLP?1受体mRNA表达变化较回肠显著，其发生的机制有待深入研究.

　　综上所述，大鼠GLP?1受体mRNA表达量在空肠表达量较低，回肠和结肠表达量较高. 糖尿病GK大鼠空肠、结肠和胰腺GLP?1受体mRNA表达量下降较回肠显著，提示空肠、结肠和胰腺GLP?1受体改变与此种动物模型糖尿病的发生发展密切相关，而其发生和作用机制有待进一步的研究.

【】
  　　［1］ Toyoda K, Okitsu T, Yamane S, et al. GLP?1 receptor signaling protects pancreatic beta cells in intraportal islet transplant by inhibiting apoptosis［J］. Biochem Biophys Res Commun, 2008, 367(4):793-798.

　　［2］ Sowden GL, Drucker DJ, Weinshenker D, et al. Oxyntomodulin increases intrinsic heart rate in mice independent of the glucagon?like peptide?1 receptor［J］. Am J Physiol Regul Integr Comp Physiol, 2007, 292(2):962-970.

　　［3］ Doyle ME, Egan JM. Mechanisms of action of glucagon?like peptide 1 in the pancreas［J］. Pharmacol Ther, 2007,113(3):546-593.

　　［4］ Xu G, Kaneto H, Laybutt DR， et al. Downregulation or GLP?1 and GIP Receptor Expression by Hyperglycemia［J］. Diabetes, 2007,56(6):1151-1558.

　　［5］ 陈元方. 胃肠肽类激素基础与临床［M］. 北京:北京医科大学协和医科大学联合出版社,1997:226-231.

　　［6］ Berghofer P, Peterson RG, Schneider K，et al. Incretin hormone expression in the gut of diabetic mice and rats［J］. Metab Clin Exper, 1997,46(3):261-267.

　　［7］ Qin XF, Shen H, Liu M， et al. GLP?1 reduces intestinal lymph flow, triglyceride absorption,and apolipoprotein production in rats［J］. Am J Physiol Gastrointest Liver Physiol, 2005,288(5):943-949.

　　［8］ Meier JJ, Gethmann A, G?tze O. Glucagon?like peptide 1 abolishes the postprandial rise in triglyceride concentrations and lowers levels of non?esterified fatty acids in humans ［J］. Diabetologia, 2006,49(3):452-458.