河豚毒素停搏液对心肌粘合连接的影响

【摘要】  目的: 研究Na+通道阻滞剂河豚毒素(TTX)停搏液对离体大鼠心肌粘合连接的影响. 方法: Wistar大鼠20只随机均分为TTX组和STH?2（St. Thomas?2)组，建立离体心脏Langendorff和Neely灌注模型，待搏动稳定，灌注30 min后停搏60 min，再灌注60 min，观察各组心脏停搏前后心率（HR）、冠状动脉流量(CAF)、左心室收缩末期压力(LVESP)以及压力变化速率(±dp/dt)的恢复率. 采用免疫组化和Western Blot检测大鼠心肌α肌动蛋白（α?actin）的分布和量的变化；免疫组化检测N型钙粘蛋白（N?cadherin）的分布及量的变化. 结果: TTX组和STH?2组的停搏时间分别为（8.55±0.68） s和（9.49±0.49） s；复搏时间分别为（10.12±0.66） s和（10.88±0.61） s，与STH?2组比较，TTX组的停搏时间和复搏时间均明显缩短 (P<0.01或P<0.05). 复搏后，TTX组和STH?2组的HR， CAF， LVESP， +dp/dt及-dp/dt的恢复率分别为（85.65±1.98）%，（91.81±2.29）%，（85.03±0.91）%，（93.59±2.22）%，（92.87±2.59）%和（77.66±1.56）%，（88.28±1.81）%，（82.24±0.82）%，（90.25±3.31）%，（88.36±4.65）%，TTX组的各项血流动力学参数恢复率均优于STH?2组(P<0.01，P<0.05). 免疫组化显示TTX组和STH?2组的N型钙粘蛋白和α肌动蛋白的表达量分别为0.06765±0.00027，0.07375±0.00049和0.02426±0.00025，0.03047±0.00017. Western Blot显示TTX组和STH?2组的α肌动蛋白的表达量分别为864.8±6.5，347.0±7.5. 与TTX组比较，STH?2组分布紊乱，量明显减少(P<0.01). 结论: 以TTX 阻断Na+通道为特点的心脏停搏液对大鼠心肌缺血?再灌注损伤时的粘合连接及心功能的保护作用优于STH?2心脏停搏液.

【关键词】  TTX停搏液；河豚毒素；钙粘着糖蛋白类；肌动蛋白类；粘合连接

　　0引言

　　粘合连接是由钙粘蛋白通过纽蛋白和α?辅肌动蛋白与胞质内肌动蛋白丝相连构成，是心肌细胞间最重要的连接结构之一［1］. 已有的研究［2-3］证实了以阻滞剂河豚毒素(tetrodotoxin, TTX)阻断Na+通道为特点的心脏停搏液对心肌缺血?再灌注损伤（myocardial ischemia/reperfusion injury， MIRI）显示出一定的优势，有关的研究主要集中在对细胞器等方面，而对细胞粘合连接的研究还少见报道. 本实验旨在观察以TTX阻断Na+通道为特点的心脏停搏液在MIRI中对粘合连接的影响，同时监测心功能的变化，以探讨其可能的机制.

　　1材料和方法

　　1.1材料成年Wistar大鼠20只，雌雄不拘，体质量200～250 g（第三军医大学大坪实验动物中心）；TTX（泰州康特生物工程公司）；N型钙粘蛋白（N?cadherin）一抗，α肌动蛋白（α?actin）一抗，生物素标记的二抗及免疫组化试剂盒（武汉博士德公司）；辣根过氧化物酶标记的二抗（北京中杉公司）；BCA蛋白浓度测定试剂盒，SDS?Page凝胶配制试剂盒，彩色预染蛋白分子量标准，PVDF膜（江苏碧云天公司）；ML870B2 Langendorff离体心脏灌流系统（澳大利亚ADInstruments公司）. Krebs?Henseleit液（K?H 液) (mmol/L) 成分：NaCl 119，NaHCO3 25，KCl 4.75，MgSO4 1.2，KH2PO4 1.18，CaCl2 1.4，Glucose 11，42.41(mol/L) O2+2.23(mol/L) CO2混合气持续氧合，维持pH 7.8（自行配制）；TTX心脏停搏液：质量浓度为20 μmol/L的TTX加入K?H液中；STH?2心脏停搏液成分(mmol/L)：NaCl 110.0，KCl 16.0，MgCl2 16.0，CaCl2 2.0，Glucose 11.0,维持pH 7.8（自行配制）.

　　1.2方法

　　1.2.1实验分组将20只大鼠随机分为TTX组和STH?2（St. Thomas?2)组，每组大鼠10只. TTX组采用TTX心脏停搏液停搏；STH?2组采用STH?2心脏停搏液停搏.

　　1.2.2实验模型的建立大鼠腹腔注射肝素盐水200 IU，20 min后脱颈处死，迅速取出心脏，建立离体鼠心Langendorff和Neely灌注模型. 用37℃, 42.41(mol/L) O2+2.23(mol/L) CO2混合气持续氧合的K?H液经主动脉根部逆行灌注，压力60 mmHg(1 mmHg=0.133 kPa)，稳定15 min. 左心房插管，左心室置入测压管，灌注液转流，转为工作心脏灌注模型，灌注压15 mmHg，后负荷52～60 mmHg，稳定5 min，测定心率（heart rate，HR）、冠状动脉流量（coronary artery flow, CAF）、左心室收缩末期压（left ventricular end systolic pressure， LVESP）、左心室最大压力变化速率（maximal rise in left ventricular pressure/maximal fall in left ventricular pressure，±dp/dt. 工作15 min后，主动脉根部按2 mL/100 g质量注入4℃心脏停搏液使心脏停搏，并观察心脏停搏时间. 停搏30 min后再经主动脉根部按2 mL/100 g质量注入心脏停搏液停搏，停搏过程中同时给予4℃盐水纱布冷敷. 停搏60 min后给予37℃, 42.41(mol/L) O2+2.23(mol/L) CO2混合气持续氧合的K?H液经主动脉根部逆行复灌，观察心脏复搏时间. 15 min后转为工作心脏灌注模型，共复灌60 min，并在工作心灌注稳定后40 min测定血流动力学参数，血流动力学参数的恢复率用复搏后的参数除以停跳前的相应参数. 20 min后停止实验，取部分左心室肌50 mg，-80℃保存，用于心肌N?cadherin和α?actin的检测.

　　1.2.3心肌N?cadherin和α?actin的免疫组化检测取3 mm×3 mm×3 mm大小心肌组织行石蜡切片，SABC法行免疫组化染色，光学显微镜观察心肌N?cadherin和α?actin的分布情况并采集图像，采用image?pro plus 6.0图像分析系统进行半定量检测，用平均吸光度A值表示N?cadherin和α?actin的相对含量.

　　1.2.4心肌α?actin的Western Blot检测取50 mg心肌组织，提取总蛋白，BCA法定量，蛋白电泳分离、转膜、抗原抗体反应及ECL显色，采用quantity one图像分析系统采集图像并行半定量分析.

　　统计学处理：采用SPSS12.0软件进行统计学分析. 血流动力学参数测定采用多功能生理记录仪(ADInstruments/8sP， Australia)，Chart 4图形、数据处理软件进行信号采集和统计. 数据以x±s表示，组间比较用两独立样本的t检验.

　　2结果

　　2.1停搏时间和复搏时间TTX组和STH?2组的停搏时间分别为（8.55±0.68） s和（9.49±0.49） s；复搏时间分别为（10.12±0.66） s和（10.88±0.61） s，与STH?2组比较，TTX组的停搏和复搏时间均明显缩短，差异均有统计学意义(停搏时间P<0.01，复搏时间P<0.05).

　　2.2血流动力学参数比较心脏停搏前，两组的血流动力学各项指标差异无统计学意义(P>0.05)；心脏复搏后40 min，TTX组的HR，CAF,LVESP和±dp/dt恢复率明显优于STH?2组，差异均有统计学意义(其中HR，CAF,LVESP，P<0.01, ±dp/dt， P<0.05，表1).

　　表1再灌注期间两组血流动力学参数恢复率（略）

　　aP<0.05,bP<0.01 vs STH?2.

　　2.3心肌组织中N?cadherin和α?actin的改变免疫组化结果显示，STH?2组心肌组织中N?cadherin和α?actin分布紊乱，其表达量较TTX组明显减少. TTX组和STH?2组的 N?cadherin和α?actin的表达量分别为0.06765±0.00027和0.07375±0.00049；0.02426±0.00025和0.03047±0.00017. Western Blot半定量分析结果显示TTX组和STH?2组的α?actin的表达量分别为864.8±6.5和347.0±7.5. STH?2组与TTX组相比较，心肌组织中N?cadherin和α?actin表达量明显减少，差异具有统计学意义（P<0.05，图1，2）.

　　A: TTX组； B： STH?2组； C: TTX组； D： STH?2组.

　　图1心肌组织N?cadherin，α?actin的表达(免疫组化) ×400（略）

　　图2Western Blot检测心肌组织α?actin的表达（略）

　　3讨论

　　N?Cadherin与α?actin都是肌小节的标志物［1］，是心肌细胞维持正常结构，进行收缩的基础. Kostetskii等［2］报道N?Cadherin基因的敲除导致了心肌细胞间粘合连接等连接结构的分解，该实验证实了N?cadherin在维持心肌细胞间连接结构完整性方面的重要性.

　　心肌细胞和细胞间连接的结构与功能是紧密联系的，MIRI时二者相互影响. 膜片嵌实验证实缺血缺氧时心肌细胞的持续Na+内流显著增加. TTX通过阻断持续的Na+流对心肌产生保护作用［3］. TTX阻断Na+通道作用直接且过程可逆，因此TTX对Na+通道阻断更迅速，再灌注后Na+通道功能恢复更快，停搏和复搏时间均明显短于STH?2组，同时也减少了能量的消耗. TTX停搏液能迅速阻断Na+通道，停搏后细胞内外离子浓度接近静息时的水平，从而使维持细胞离子内稳态的离子泵耗能降到最低限度，节省能量物质. 我们的前期研究也已证明TTX极化停博可明显减少心肌能量消耗［4］. 伴随着ATP水解，α?actin的稳定性随之降低；离子泵转运功能障碍，Ca2+进入细胞激活Ca2+依赖性蛋白酶，再灌注时，经一系列反应产生大量的超氧阴离子和过氧化氢；同时ATP减少使Ca2+进入线粒体增多，使线粒体功能受损，使氧自由基生成增多，清除减少，最终导致N?Cadherin和α?actin的损伤. Powell等［5］报道了缺血后收缩功能的失调是由于收缩蛋白氧化. TTX能够选择性阻断失活缓慢的Na+电流，衰减Na+窗口电流，减轻Na+超载和Ca2+超载，从而避免了对线粒体的损伤，增加了能量的供应；减轻了对自由基生成的促进作用；避免了对各种酶类的激活，其中由Ca2+超载引起的钙蛋白酶激活可能具有重要作用［6］，因而有效地减轻了MIRI.

　　综上所述，TTX对心肌N?Cadherin和α?actin的影响，对心肌粘合连接的其他结构，N?Cadherin与α?actin之间的关系，TTX对心肌粘合连接的作用机制等尚需进一步研究.

【】
  　　［1］ Bird SD, Doevendans PA, van Rooijen MA, et al. The human adult cardiomyocyte phenotype［J］. Cardiovasc Res， 2003，58(2):423-434.

　　［2］ Kostetskii I, Li J, Xiong Y， et al. Induced deletion of the N?cadherin gene in the heart leads to dissolution of the intercalated disc structure［J］. Circ Res，2005，96(3):346-354.

　　［3］ Saint DA. The role of the persistent Na(+) current during cardiac ischemia and hypoxia［J］. J Cardiovasc Electrophysiol，2006，17(1):S96-S103.

　　［4］ 谭松涛，杨双强，杨朝坤. Na+通道阻滞极化停搏液在离体大鼠心脏保存中的保护作用［J］. 第一军医大学学报，2005，25(10)：1283-1285.

　　［5］ Powell SR, Gurzenda EM, Wahezi SE. Actin is oxidized during myocardial ischemia［J］. Free Radic Biol Med，2001，30(10):1171-1176.

　　Kim MJ, Oh SJ, Park SH, et al. Hypoxia?induced cell death of HepG2 cells involves a necrotic cell death mediated by calpain［J］. Apoptosis，2007，12(4):707-718.