慢性低O2高CO2对大鼠海马Bcl-2、Bax基因表达和细胞凋亡的影响

【摘要】  目的:探讨慢性低O2高CO2对大鼠海马神经细胞凋亡的诱发作用及对Bcl-2、Bax基因表达的影响。方法:雄性SD大鼠50只，随机均分成5组：正常对照组（NC）、低O2高CO21周组（1HH）、2周组（2HH）、3周组（3HH）和4周组（4HH）。采用TUNEL法检测海马神经细胞凋亡；以RT-PCR检测海马Bcl-2 mRNA和Bax mRNA的表达。结果:随着低O2高CO2时间延长，凋亡指数(AI)及Bax mRNA水平进行性升高；Bcl-2 mRNA先升高后下降（均P<0.01）。AI与Bax mRNA之间呈显著正相关（r=0.814，P<0.01），而与Bcl-2 mRNA/Bax mRNA比值之间呈显著负相关（r=-0.405，P<0.01）。结论:慢性低O2高CO2可以诱发大鼠海马神经细胞凋亡，Bcl-2/Bax比值下降是促进凋亡的重要因素。

【关键词】  海马 低氧 高碳酸血症 凋亡 Bcl-2 Bax

    Abstract:  Objective: To explore the inducing effect of chronic hypoxic hypercapnia on the apoptosis of rat neural cells in the hippocampus, and the relationship between the apoptosis and Bcl-2 as well as Bax gene expression. Methods: Fifty male spragu-dawley rats were randomly divided into five groups: normal control group (NC), hypoxic hypercapnia 1-week (1HH), 2-week (2HH), 3-week (3HH) and 4-week (4HH) group. The in situ cell apoptosis in the hippocampus was detected with TUNEL staining. The expression of Bcl-2 and Bax mRNA in the hippocampus were examined with RT-PCR. Results: Apoptosis index (AI) and the expression Bax mRNA were progressirely increased with the prolongation of duration of hypoxic hypercapnic exposure, and the expression of Bcl-2 mRNA was increased at first, then declined. There was a significant positive correlation between AI and the expression of Bax mRNA (r=0.814, P<0.01), and there was a significant negative correlation between AI and the ratio of Bcl-2 mRNA/Bax mRNA (r=-0.405, P<0.01). Conclusion: Apoptosis can be induced by chronic hypoxic hypercapnia in rat hippocampus. The ratio of Bcl-2/Bax decline accelerates the occurrence of apoptosis.

    Key words:   hippocampus; hypoxia; hypercapnia; apoptosis; Bcl-2; Bax

    临床上慢性阻塞性肺疾病（chronic obstruc-tive pulmonary disease，COPD）由于通气功能障碍常引起低氧血症或伴高碳酸血症，病情持续可导致肺性脑病。动物实验也发现，慢性低氧能够引起脑组织结构和功能的损害[1，2]，但迄今为止，其发生机制尚未完全阐明。近年来研究发现，细胞凋亡可能在慢性低氧性脑损害中起重要作用[3]。本实验采用慢性低O2高CO2性肺动脉高压大鼠模型，通过不同低O2高CO2干预时间（1周、2周、3周、4周），动态观察大鼠海马神经细胞凋亡及凋亡相关基因表达的变化，初步探讨慢性低O2高CO2大鼠海马神经细胞凋亡的可能机制。

    1  材料和方法

    1.1  主要材料  常压低02高CO2舱（温州医学院肺心病研究室研制），CYESIl型O2、CO2气体测定仪（上海市嘉定学联仪表厂生产），Medlab生物信号采集处理系统（南京美易科技有限公司生产），TUNEL试剂盒（武汉博士德生物工程有限公司生产），梯度PCR仪（Effendorf公司生产），RT-PCR试剂盒（Fermentas公司提供）。

    1.2  动物分组及模型制备[4]  雄性SD大鼠50只（温州医学院实验动物中心提供），体重180～220 g。随机分成5组：即正常对照组（NC）、低O2高CO21周组（1HH）、2周组（2HH）、3周组（3HH）和4周组（4HH），每组10只。将后4组动物放入常压低O2高CO2舱内，舱内充入氮气（N2）使O2浓度维持在9%～11%，CO2浓度维持在5.5%～6.5%，每天8 h，连续1周（1HH组）、2周（2HH组）、3周（3HH组）或4周（4HH组）。对照组大鼠除吸入空气外，其他饲养条件与各低O2高CO2组相同。动物饲养到规定时间后，用戊巴比妥钠（35 mg/kg）腹腔麻醉，右心导管法测定平均肺动脉压（mPAP）、平均颈动脉压（mCAP）。

    1.3  取材和标本制作  经左颈总动脉插管处用4 ℃生理盐水200 m1灌注10 min。将大鼠断头，取脑置于冰盘上，快速分离出左、右海马。左侧海马置于液氮迅速冷冻，再放-70 ℃冰箱保存，用于RT-PCR检测。右侧海马放入4%多聚甲醛中固定4 h，依次进行梯度酒精脱水、二甲苯透明、浸蜡、包埋、5μm厚连续切片，用于细胞凋亡检测。

    1.4  海马神经细胞凋亡原位检测  采用原位缺口末端标记（TUNEL）法，按试剂盒提供方法操作。镜检细胞核中有棕黄色颗粒者为凋亡细胞。随机5个高倍视野（×400）下的凋亡细胞数。凋亡指数（apoptosis index，AI）以凋亡细胞/100个细胞（%）表示。

    1.5  Bcl-2和Bax基因的RT-PCR检测  Bcl-2和Bax引物根据Genebank资料，利用primer 5.0引物设计软件确定最优引物，然后经Blast匹对，由上海生工生物有限公司合成。Bcl-2引物：上游为5'-CTGGTGGACAACATCGCTCTG-3'，下游为5'-GGTCTGCTGACCTCACTTGTG-3'，扩增片段228 bp；Bax引物：上游为5'-GCGAATTGGAGATGAACTGG-3'，下游为5'-GTGAGCGAGGCGGTGAGGAC-3'，扩增片段366 bp。以GAPDH作为内参照，引物序列：上游为5'-AGTATGACTCCACTCACGGCAA-3'，下游为5'-TCTCGCTCCTGGAAGATGGT-3'，扩增片断100 bp。

    取左侧海马组织匀浆后，提取1μl RNA样品，采用紫外分光光度法测定RNA纯度，以OD260/OD280的比值表示，要求比值在1.8～2.0之间。取2μg RNA，采用M-MLV逆转录酶，按20μl体系，42 ℃，逆转录1 h。多聚酶反应总体系为20μl（包含GAPDH引物），所有引物退火温度为56 ℃，扩增35个循环，脂糖电泳，溴乙啶染色，紫外灯照相，凝胶图像扫描。

    1.6  统计分析  多组样本均数比较进行方差齐性检验，组间比较采用单因素方差分析，方差齐性者用LSD检验，方差不齐者用Dunnett's T3检验。双变量相关分析用Pearman直线相关分析法分析。

    2  结果

    2.1  低O2高CO2对大鼠mPAP、mCAP、RV/（LV+S）的影响  慢性低O2高CO2各组mPAP、RV/（LV+S）均高于正常对照组（均P<0.01），mPAP、RV/（LV+S）在慢性低O2高CO2 2周时达最高，3～4周渐趋稳定。各组间mCAP差异无显著性（均P>0.05）。见表1。

    2.2  大鼠海马细胞凋亡检测  NC组海马神经细胞少量凋亡（见图1）；低O2高CO2各组与NC组比较，细胞凋亡均显著增加（P<0.05或P<0.01）。随着低O2高CO2时间的延长，细胞凋亡有逐渐增多的趋势，4HH组TUNEL阳性细胞最多（见图4）。4HH组AI较1HH组高261.6%（P<0.01），较2HH组高71.4%（P<0.01），较3HH组增高不明显（见表2）。

    2.3  海马Bcl-2 mRNA和Bax mRNA的表达及Bcl-2/Bax比值  低O2高CO2各组海马Bcl-2 mRNA和Bax mRNA表达上调，与NC组比较均有显著性差异（均P<0.01）。随着低O2高CO2时间延长，Bcl-2 mRNA表达先升高而后下降（见图5），而Bax mRNA表达逐渐增高（见图6）。Bcl-2/Bax比值的变化趋势同Bcl-2 mRNA，即随着低O2高CO2时间的延长，先升高而后下降（见表2）。

    2.4  相关性分析  将海马神经细胞AI与Bcl-2 mRNA、Bax mRNA及Bcl-2 mRNA/Bax mRNA的比值作相关分析表明：AI与Bax mRNA之间存在显著正相关（r=0.814，P<0.01），而与Bcl-2 mRNA/Bax mRNA比值之间存在显著负相关（r=-0.405，P<0.01）。

    3  讨论

    慢性低氧能够引起脑组织结构和功能的损害，细胞凋亡被证实在其中起着重要作用[2，3]。Gozal等[5]在研究大鼠间断性低氧模型时发现，在间断低氧14 d时，大鼠皮层和海马区细胞凋亡达到高峰。Xu等[6]在Gozal实验基础上进一步研究发现，在间断性低氧21 d、30 d时，细胞凋亡出现下降的趋势。而本实验显示，海马细胞凋亡指数随低O2高CO2时间延长呈逐渐升高，在第4周时未见下降。据推测可能是不同的实验条件和动物模型使脑细胞凋亡出现不同变化趋势。另外，本实验与低O2同时存在的高CO2也可能是造成这种趋势的重要因素。因为，高CO2能明显抑制低氧诱导的脑血管密度增加，通过抑制脑血管重建而加重低氧性脑损害[7，8]；高CO2使大脑乳酸根浓度明显增加及葡萄糖浓度明显减少，使大脑发生能量代谢障碍[9]。

    细胞凋亡是许多基因参与的程序化过程，有着非常复杂的调控机制，其中，Bcl-2基因家族是目前较为公认与凋亡密切相关的基因。Bcl-2家族包括两类成员，一类如Bcl-2、Bcl-xl等抑制凋亡发生，另一类如Bax、Bak、Bcl-xs、Bad、Bid、Bik等促进凋亡发生，Bcl-2/Bax增大时促进细胞存活，反之则导致细胞凋亡[10]。本实验观察到，随着低O2高CO2干预时间的延长，海马Bcl-2 mRNA表达先升高后下降。这种变化出现的原因，可能是由于在低O2高CO2损伤早期，首先启动了Bcl-2基因表达以阻止细胞凋亡；而随着低O2高CO2时间延长，其他诱导凋亡因素持续存在，细胞损伤不断加重，最终Bcl-2的表达被抑制，细胞继而发生凋亡。另外，随着低O2高CO2干预时间的延长，海马Bax mRNA表达逐渐增多，表明低O2高CO2可引起海马Bax表达增多，进而诱导细胞凋亡，因而Bcl-2/Bax比值逐渐下降，海马神经细胞AI逐渐增高，两者呈显著负相关。本实验提示，慢性低O2高CO2可以诱发大鼠海马神经细胞凋亡。Bcl-2/Bax比值下降可能是促进凋亡的重要因素。

【】
  [1] Mikati MA, Zeinieh MP, Kurdi RM, et al. Long-term effects of acute and of chronic hypoxia on behavior and on hippoc- ampal histology in the developing brain [J]. Brain Res Dev Brain Res, 2005, 157(1): 98-102.

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[3] Schwartz ML, Vaccarino F, Chacon M, et al. Chronic neona- tal hypoxia leads to long term decreases in the volume and cell number of the rat cerebral cortex [J]. Semin Perinatol, 2004, 28(6): 379-388.

[4] 胡良冈, 龚永生, 范小芳, 等. 常压低氧高二氧化碳清洁级动物饲养舱的研制[J]. 医疗卫生装备, 2003, 24(4): 16-17.

[5] Gozal D, Daniel JM, Dohanich GP. Behavioral and anatomi- cal correlates of chronic episodic hypoxia during sleep in therat [J]. J Neurosci, 2001, 21(7): 2442-2450.

[6] Xu W, Chi L, Row BW, et al. Increased oxidative stress is associated with chronic intermittent hypoxia-mediated brain cortical neuronal cell apoptosis in a mouse model of sleep apnea [J]. Neuroscience, 2004, 126(2): 313-323.

[7] Xu K, Puchowicz MA, LaManna JC. Renormalization of re-gional brain blood flow during prolonged mild hypoxic expo-sure in rats [J]. Brain Res, 2004, 1027(1-2): 188-191.

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