弓形虫三磷酸核苷水解酶基因的克隆与序列分析
【摘要】 目的:克隆并分析我国刚地弓形虫三磷酸核苷水解酶（NTPase）的编码基因。方法:采用聚合酶链反应（PCR）扩增弓形虫RH株的NTPase基因，克隆入pGEM-T Easy载体，转化后挑取阳性克隆进行酶切与测序鉴定，并对获得的NTPase基因及推导的氨基酸序列进行生物信息学分析。结果:PCR扩增得到特异的弓形虫NTPase基因序列，测序结果表明，获得的弓形虫NTPase-Ⅱ基因全长1 812 bp，编码的603个氨基酸与Genebank报道的氨基酸序列同源性为100%。经DNAStar预测NTPase-Ⅱ存在6个潜在抗原表位。结论:成功克隆出序列正确的弓形虫NTPase-Ⅱ基因，为其相关研究奠定了基础。
【关键词】 弓形虫 核苷水解酶 克隆 序列分析
Abstract: Objective:To clone and analyze the nucleoside triphosphate hydrolase (NTPase) gene of Toxoplasma gondii. Methods: The NTPase gene was amplified by polymerase chain reaction (PCR) from RH strain of Toxoplasma gondii and cloned into pGEM-T Easy vector. Positive clones were screened and identified by BglⅡ、HindⅢ digestion and sequenced. The DNA sequence and its deduced protein sequence were analyzed. Results: The NTPase gene was specifically amplified, DNA sequence analysis showed that the length of cloned gene was 1 812 base pair. The homology of this deduced amino acids sequence was 100% to that in the Genebank. Conclusion: The NTPase-Ⅱ gene is successfully cloned, providing basis for the future research about this gene.
Key words: Toxoplasma gondii; NTPase; cloning; sequencing
刚地弓形虫（Toxoplasma gondii）是专性细胞内寄生的机会致病性原虫，呈世界性分布。三磷酸核苷水解酶（nucleoside triphosphate hydrolase，NTPase）为分布于弓形虫速殖子表面一种主要特异性抗原[1，2]，其对虫体在宿主细胞内的寄生和繁殖都具有重要的作用[3]。目前，国内关于弓形虫病诊断和疫苗候选抗原的研究主要集中在P30（SAG1）和P22抗原[4-6]，而对NTPase的研究鲜见报道。因此，我们对弓形虫RH株的NTPase基因进行扩增与克隆，为下一步的研究奠定基础。
1 材料和方法
1.1 虫株和试剂 弓形虫RH株由浙江省医学研究院寄生虫病研究所惠赠；E.coli DH5α为本室保存；pGEM-T Easy载体购自Promega公司。淋巴细胞分离液购自Sigma公司；限制性内切酶BglⅡ、HindⅢ和基因组DNA提取试剂盒均为大连宝生物产品；2×PCR Master Mix试剂盒购自上海晶美生物技术有限公司；小量质粒抽提试剂盒购自宁波中鼎生物技术公司；200 bp Marker及DNA凝胶回收试剂盒为上海生物工程技术有限公司产品。
1.2 模板DNA制备 弓形虫RH株速殖子连续在小鼠体内传代，感染3 d后无菌操作抽取腹水，虫体用生理盐水洗涤3次，加入与虫体混悬液等量的淋巴细胞分离液，800 r/min离心8 min后加速至2 000 r/min离心10 min，收集中层虫体[7]，按DNA提取试剂盒说明书抽提弓形虫基因组DNA，用分光光度法测定DNA的浓度和纯度。
1.3 PCR扩增 根据弓形虫NTPase核苷酸序列[8]和表达载体克隆位点内切酶图谱分析结果，采用Primer Designer引物设计软件自行设计引物，由上海基康生物技术公司合成，引物序列如下：上游引物：5'-GAAGATCTACAGACTCATCGTCACT CCG-3'（下划线为BglⅡ酶切位点），下游引物：5'-GCAAGCTTTCACAGATTGTGAGAATATCC-3'（下划线为HindⅢ酶切位点）。采用2×PCR Master Mix试剂盒扩增NTPase基因，PCR反应总体积为50μl：其中含有模板DNA 5μl（200 ng），上下游引物各1μl（终浓度为0.4μmol/L）。同时设立空白对照。PCR反应参数：95 ℃ 5 min×1；95 ℃ 45 s，58 ℃ 45 s，72 ℃ 60 s×30；72 ℃ 10 min×1。1.5%的琼脂糖凝胶电泳鉴定并切胶回收。
1.4 T-A克隆及测序 回收的PCR产物与pGEM-T Easy载体16 ℃过夜连接。连接体系为10μl：纯化的PCR产物3μl，2×buffer 5μl，pGEM-T Easy Vector 1μl，T4 DNA连接酶1μl。连接产物转化感受态E.coli DH5α，吸取200μl转化后的感受态细菌涂布于含氨苄青霉素的LB平板上，筛选阳性克隆。阳性重组子经培养和提取质粒后，分别进行BglⅡ和HindⅢ双酶切及PCR鉴定，并送上海基康生物技术公司测序。测序结果采用DNAMAN软件与Genebank公布的弓形虫NTPase基因[9]序列进行比较，并推导其编码的氨基酸序列。对获得的基因及其氨基酸序列的同源性、保守功能域、二级结构等进行生物信息学分析。
2 结果
2.1 PCR扩增结果 从弓形虫RH株DNA模板中扩增获得预期大小（1 812 bp）的目的条带（见图1）。
2.2 序列测定及推导的氨基酸序列的生物信息学分析
2.2.1 物理化学性质预测：测定的弓形虫NTPase编码区基因长1 812 bp，A+T含量为47.8%，G+C含量为52.2%，预测编码603个氨基酸，理论等电点为5.72，Mr为66 900，其中含80个碱性氨基酸（K、R、H），78个酸性氨基酸（D、E），275个非极性疏水性氨基酸（G、A、V、L、I、F、P），170个极性氨基酸（W、S、Y、C、M、N、Q、T）。获得的NTPase编码基因及推导的氨基酸序列见图2。
2.2.2 同源性分析：用NCBI的BLASTN程序对弓形虫NTPase编码基因序列进行核苷酸的同源性分析，结果显示获得的基因序列与GenBank上提交的NTPase-Ⅱ基因同源性达100%。
2.2.3 抗原表位预测：用DNAStar软件对弓形虫NTPase-Ⅱ可能的抗原表位进行预测，NTPase-Ⅱ氨基酸序列中存在6个潜在的抗原表位（见表1）。
2.2.4 保守功能域分析：用Expasy的ScanProsite程序分析推导的弓形虫NTPase-Ⅱ氨基酸序列的保守功能域，发现在206～221位氨基酸具有GDA1/CD39家族的核苷磷酸酶标志。氨基酸序列中还存在cAMP、cGMP依赖的蛋白激酶磷酸化位点(aa 82～85)、酪蛋白激酶Ⅱ磷酸化位点(aa 207～210、317～320、341～344、354～357、409～412、422～425、444～447、465～468、475～478、593～596)、N末端十四酰化位点(aa 47～52、208～213、239～244、254～259、303～308、324～329)、蛋白激酶C磷酸化位点(aa 5～7、13～15、26～28、50～52、74～76、223～225、273～275、379～381、465～467、475～477)、酰胺化位点（aa 80～83）、N末端糖基化位点（aa 407～410）、酪氨酸激酶磷酸化位点（aa 592～599）。
2.2.5 二级结构预测：用Expasy的predictprotein（PROFpredictions）预测，弓形虫NTPase-Ⅱ的氨基酸二级结构α螺旋（H）与β片层（E）和卷曲环（L）之比为25.37∶15.26∶59.37，属于混合型，核心氨基酸与暴露残基之比为46.77∶53.23，卷曲环区与平均柔曲性高峰区基本一致。
3 讨论
弓形虫NTPase是弓形虫在宿主细胞内环境下获得嘌呤的寄生机制而产生的，对弓形虫的寄生和繁殖都具有重要的作用。体外研究发现，弓形虫产生的NTPase在二巯基化合物的激活作用下，能连续水解所有的三磷酸核苷和三磷酸脱氧核苷至单磷酸形式[3]。感染宿主细胞的弓形虫速殖子即是利用NTPase分解宿主细胞来源的ATP，以合成维持自身生存所必需的嘌呤核苷酸。
NTPase蛋白有NTPase-Ⅰ和NTPase-Ⅱ两种亚型，组成两亚型的628个氨基酸中只有16个残基不一样，两亚型的编码基因有31个碱基不同且均不含有内含子[9]。Nakajima K等[8]曾报道，使用NTPase-ELISA试验血清学诊断急性弓形虫病与Sabin-Feldman标准染色试验具有很好的相关性，且NTPase两亚型间的抗原性并无明显区别。Kikuchi等制备的特异性抗NTPase单克隆抗体6C6可与弓形虫强毒力株和非毒力株的4种不同的NTPase异构酶分子均发生反应，即6C6可识别4种NTPase异构酶的共同表位[10]。NTPase-Ⅱ亚型存在于弓形虫的所有虫株中，且具有强抗原性和较好的免疫反应性。本实验成功克隆出NTPase-Ⅱ基因，其测序结果与Genbank登陆序列L39079比较，核苷酸序列同源性高达100%，说明NTPase-Ⅱ为高度保守基因。本实验预测得NTPase-Ⅱ蛋白具有6个潜在的抗原表位，为我们今后表达重组NTPase蛋白用于弓形虫感染的免疫诊断和疫苗候选抗原的筛选奠定了基础。
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