游离锌离子形态学检测方法探究

【摘要】  目的:使用ivZnSAMG、ZnSeAMG、iZnSAMG、TSQ荧光、Zinquin荧光对海马苔藓游离锌离子进行染色和比较。方法: ivZnSAMG：采用Na2S溶液灌流的锌离子结合方式；ZnSeAMG：采用事先注射硒酸钠的体内锌离子结合方式；iZnSAMG：采用取动物新鲜组织浸泡在浸染液中的锌离子结合方式；以上三种方法处理后均采用相同的AMG孵育显色。TSQ、Zinquin荧光 :均为新鲜组织取材，液氮处理后荧光下观察。结果：在小鼠海马，所有染色方法均能标记出苔藓纤维的染色，各种染色在苔藓纤维标记有细节上的差异。所有染色方法中特异性最高的是ZnSeAMG；但其敏感性相对较差。而ivZnSAMG的敏感性最高，而其特异性则相对较差。结论：本实验中使用的游离锌离子染色方法都能成功的对游离锌离子进行标记，而这些染色方法的特异性和敏感性各有不同，对染色细节的雕琢能力也各有不同，因此可以根据这些方法的各自特点在实验选取适合的方法。

【关键词】  游离锌离子；N?(6?methoxy?8?quinolyl)?p?toluene?sulfonamide (TSQ)荧光技术；金属自显影；Zinquin荧光技术；苔藓纤维

    ＡｂｓｔｒａｃｔObjective:To compare the difference dying results of the  free zinc in the hippocampus mossy fiber between the different methods such as Na2SAMG、ZnSeAMG、iZnSAMG、TSQ fluorescence and Zinquin fluorescence. Method: Na2SAMG：zinc was combined with sodium sulphide perfusion; ZnSeAMG：zinc was combined with injection sodium selenite in advanced；iZnSAMG：the animal's fresh tissue immersed in the Timm's immersion fluid. Aboved three methods were followed by the same AMG method. TSQ、Zinquin fluorescence :the animal's fresh tissues were observed under the fluoresence microscope after the frozen in the liquid nitrogen. Results: In the hippocampus of the mice, the mossy fiber could be stained by all of the aboved methods. However there were some differences between them in details. Among all of the methods mentioned above, the ZnSeAMG method had the most   specificity and the lowest sensibility but the ivZnSAMG method on the contrary properly. Conclusion:All of the above methods could catch the zinc, but the specificity and sensibility are different respectively. Therefore these different methods are used in the different experiments with the different destination.

    Ｋｅｙ　ｗｏｒｄｓ free zinc; N?(6?methoxy?8?quinolyl)?p?toluene?sulfonamide (TSQ) fluorescence; AMG (autometallography); Zinquin fluorescence; mossy fiber

    目前，检测锌离子的手段很多，其中检测细胞内外游离锌离子的形态学手段主要有两种，即金属自显影术(autometallography, AMG)和；N?(6?methoxy?8?quinolyl)?p?toluene?sulfonamide (TSQ)和Zinquin锌荧光探针技术。Timm创始了著名的硫化银染色法，该方法是将“物理显影”的知识转而应用到重金属组织化学上。“物理显影”是19世纪由一位摄影家发明的，并由Liesegang作为一种组织化学工具应用到组织学中，目的是使在银盐中暴光的组织中的银颗粒放大。自从Timm引入了“某些金属硫化物可以通过物理显影被银放大”的观念，许多家应用了这一方法，并试图改进这一技术，而且已经发现了新的可以被银放大的金属微晶。在20世纪80年代早期，Timm的硫化银法是成功的锌特异性显示法［1］。同时，出现了硒技术，该技术可以在体内含锌神经元终末产生硒化锌和逆向轴突示踪含锌神经元［1-3］。由于人们对银放大过程的逐渐理解，在组织化学领域，'金属自显影术'逐渐替代了'物理显影'这一名词。AMG技术也演化出多种类型的2价金属离子追踪技术［4］。但无论AMG技术如何演化，其根本原理仍然是使用银颗粒对2价离子化合物进行包裹，并对2价金属离子信号进行放大进而进行观测。本实验采的硫化钠技术、硒技术就是从上述AMG方法中演化而来［4］。此前，我们曾应用AMG技术报道了锌离子在脉络丛、视网膜、脊髓、小脑等部位的分布情况［5-9］。海马是神经系统内含锌最多的通路之一［4］，因此本实验采用海马做为锌离子染色的材料。

     １  材料与方法

    1.1  实验动物及分组  实验动物为CD?1小鼠10只，体重30～35g，雌雄不限，由医科大学实验动物部提供。根据五种不同的染色方法将动物分为5组，每组2只，分笼饲养，常规饮食。

    1.2  主要试剂和药品  TSQ荧光染色试剂(Invitrogen);Zinquin荧光染色试剂(日本，Dojindo Caboratories);乳化银(Fluka);戊巴比妥钠(Sigma);恒冷箱切片机(Leica);双目光学显微镜(Olympus)。

    1.3  实验方法

    1.3.1  AMG浸染法(iZnSAMG)  实验动物2只，均用氯化钠肝素溶液〔9ml 0.9%氯化钠 + 1ml肝素（500IU/ml）〕灌流30s，直接用250ml 3%的戊二醛固定液灌流15min。所有的溶液均用0.5M的索伦森磷酸盐溶液缓冲。迅速取脑组织，并将组织放在快速组织切片机上，切出1～2mm厚的切片，将切片浸入改良Timm溶液中，即浸入含0.1%硫化钠和3%戊二醛的0.1M的索伦森磷酸盐缓冲液中，pH为7.4。将染缸置于震荡器上，保持4℃。72h后，将切片用0.1M的磷酸盐缓冲液小心冲洗10min。用于光镜的：将切片放入30%蔗糖溶液中，直至切片沉到玻璃杯底部。将切片用CO2冷冻后快速置于冰冻切片机上，降温至-17℃，切10μm切片，然后切片置于AMG孵育液［1］内并在恒温(26℃) 振动水浴箱内孵育60min，常规脱水透明后，中性树胶封片，在光学显微镜下观察。

    1.3.2  硒酸钠注射AMG法（ZnSeAMG)  实验动物2只，首先动物预先注射0.1%硒酸钠30mg/kg，待动物奄奄一息濒死时腹腔注射4%戊巴比妥钠麻醉，暴露心脏，用蠕动泵经左心室灌注生理盐水及2.5%戊二醛灌流，迅速取脑，然后将脑组织放入2.5%戊二醛固定液中后固定4～6h，然后置于30%蔗糖溶液中，直至组织块沉到玻璃杯底部。常规10μm冰冻切片机切片，然后切片置于AMG孵育液［1］内并在恒温(26℃) 振动水浴箱内孵育60min，常规脱水透明后，中性树胶封片，在光学显微镜下观察。

    1.3.3  硫化钠灌流AMG法(ivZnSAMG)  实验动物2只，颈椎离断后，首先灌注0.3％硫化钠溶液10min大约150ml，然后灌注生理盐水10min大约150ml，最后灌注2.5％戊二醛10min大约150ml。迅速取大脑组织、2.5％戊二醛后固定3h。然后标本置于30%蔗糖液4℃冰箱保存过夜。次日，标本用恒冷切片机制备10μm的冰冻切片，切片置于AMG孵育液［1］内并在恒温(26℃) 振动水浴箱内孵育60min，常规脱水透明后，中性树胶封片，在光学显微镜下观察。

    1.3.4  Zinquin荧光染色  实验动物2只，过量麻药处死，迅速取脑，放入液氮中，10min后，将脑组织放入冰冻切片机中，冰冻切片20μm，空气中晾干。冷丙酮固定10min，Zinquin荧光溶液（1∶50）孵育2h（避光），0.1M PBS冲洗3次各10 min（避光）。荧光显微镜观察，360nm紫外光激发。

    1.3.5  TSQ荧光染色  实验动物2只，过量麻药处死，迅速取出大脑，放入液氮中，10min后，将脑组织置于冰冻切片机中，冰冻切片20μm，空气中晾干。避光条件下，切片浸入4.5μM TSQ溶液中孵育60～90s，然后用0.9%生理盐水冲洗60s。荧光显微镜观察，360nm紫外光激发。

    2  结果

    2.1  iZnSAMG、ZnSeAMG、ivZnSAMG在小鼠海马的染色  从图1中可以看出，染色呈棕黑色的部分为游离锌离子的分布区域。三种方法均能准确的标记出苔藓纤维，而且也能标记出苔藓纤维之外的游离锌离子分布情况。图1?1为ZnSeAMG的染色情况，可见苔藓纤维被渲染的很好，细节突出，且在整个海马很少发现非特异性的染色。图1?2为ivZnSAMG的染色情况，可见苔藓纤维染色较好。苔藓纤维外的锌离子染色也很清晰，整体染色强度明显高于ZnSeAMG染色法，而图片可见一些非特异性的染色杂质。图1?3为iZnSAMG染色情况，整体染色强度略强于ZnSeAMG而低于ivZnSAMG，且一些神经胶质细胞也发现AMG阳性反应。

    图1  小鼠海马三种AMG反应阳性颗粒的分布 40×

    图1?1为ZnSeAMG的染色结果；图1?2为ivZnSAMG的染色结果；图1?3为iZnSAMG染色结果2.2  TSQ、Zinquin荧光  从图2中可以发现两种荧光染色法均能标记出苔藓纤维。图2中1?2为TSQ荧光的染色情况，可见齿状回部分和CA3部分的苔藓纤维均被明显标记，且强度较高。图2中3?4为Zinquin荧光的染色情况，齿状回部分和CA3部分的苔藓纤维也均被明显标记，但荧光染色强度要低于TSQ法。

　　3  讨论

    机体内游离锌离子的染色方法众多，主要有各种AMG染色方法以及各种锌离子染色荧光。对于各种锌离子染色的特点缺乏专门的进行报道，因而使实验方法的选择成了一个难题。本实验使用5种比较常规的机体内游离锌离子追踪的染色方法，对其染色特点进行了比对。在本次实验中，我们发现ZnSeAMG染色法对游离锌离子的特异性很高，但其染色强度稍差，因此非常适用于一些含锌较多的区域来体现游离锌离子染色的细节，譬如对小鼠癫痫后海马苔藓纤维出芽（MFS）进行染色。此前，我们曾使用此方法对匹罗卡品小鼠癫痫模型的海马的MFS进行了染色，取得了较好的效果［１０］。ivZnSAMG染色法对游离锌离子的敏感性非常高，其染色强度是3种AMG染色中最高的，但非特异性反应稍多，此种方法比较适用于含锌量较少的组织部位；而且由于其采用了组织灌流Na2S的锌离子结合方式，所以对组织内游离锌离子的结合存在着即时性，非常适合捕捉机体某种生理状态或病理态下锌离子的分布状态。iZnSAMG在3种AMG染色方法中特异性和敏感性居中，显得特点不足，但是此种方法可以使一些神经胶质细胞着色，这个染色特点也许可以做为神经胶质细胞染色方法方面的一个方向。另外，浸染法的锌离子结合是新鲜组织浸泡于浸染液中，因此其标本中染色差异是3种AMG方法中最低的，基本不受动物的个体差异影响，非常适合做锌离子浓度在不同动物之间的比对。

    本实验还采用了TSQ、Zinquin两种荧光染色法对海马苔藓纤维进行了染色。两种荧光染色均能标记出苔藓纤维，但其荧光染色与AMG类染色方法相比，染色弥散且缺乏对细节的渲染能力。因此这两种荧光染色法适用于对染色细节要求不高而对染色敏感性要求较高的实验，譬如一些体外培养细胞的实验。另外，两种荧光染色可以与其他物质进行荧光下的双重标记甚至三重标记，可以检测出体内游离锌离子与其他的检测物质之间的相互分布情况，这个优势是3种AMG方法所不具备的。

    在三种AMG染色法中本实验均采用戊二醛固定。戊二醛固定效果好并且对微细结构保存完整，是我实验室应用AMG染色法的常规固定液。但是戊二醛相对于丙酮的渗透性要弱一些，因此在厚一些，大块的组织固定时一般选用丙酮固定。冷丙酮对抗原的影响较小，能保持抗原的特异性并且对组织的渗透力强，由于本实验取材时取脑组织，而且切片较厚，考虑到丙酮的强渗透性，故采用丙酮固定，并取得较好结果。

【文献】
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［4］Danscher G, Stoltenberg M. Silver enhancement of quantum dots resulting from (1) metabolism of toxic metals in animals and humans,(2) in vivo, in vitro and immersion created zinc-sulphur/zinc-selenium nanocrystals, (3) metal ions liberated from metal implants and particles ［J］. Prog Histochem Cytochem,2006, 41: 57-139.

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