多药耐药相关蛋白在人肝细胞癌亚群细胞中的表达及意义

【摘要】  目的 检测肝细胞癌异质性亚群细胞对化疗药物的耐药差异，探讨耐药蛋白在肝癌组织中不同亚群细胞的表达意义。方法 ①通过MTT法分别测定人肝细胞癌异质性亚群细胞在不同浓度、不同化疗药物（ADM、VP-16、DDP）作用下的抑制率，每种药物IC50值。② 应用流式细胞仪分别检测耐药相关蛋白MDR1、MRP、LRP、GST在两亚群细胞中的表达率。结果 ①LCSC-1和LCSC-2亚群细胞对阿霉素（ADM）、顺铂（DDP）、鬼臼乙叉苷(VP-16)等药物都产生了耐药性（F＝249.651）。三种药物对LCSC-2亚群细胞和LCSC-1亚群细胞抑制率有显著差异 (P<0 .01)。②LCSC-1和LCSC-1亚群细胞MDR1、MRP、LRP、GST的表达量分别是：（23.97± 0.34）% 、（17.03±0.59）% 、（24.02±0.63）% 、（23.93± 0.59）% ；（26.59± 0.78）% 、（19.43± 0.60）% 、（26.43±1.06）% 、（26.24±1.06）% ；两亚群比较，t=5.32 ，P=0.006；t=4.94 ，P=0.008；t=3.85，P=0.028；t=3.30，P=0.030。两亚群细胞MDR1、MRP、LRP、GST的表达有显著性差异。结论 MRP、LRP、GST、MDR1的高表达，可能是人肝癌细胞异质性亚群多耐药产生的部分分子基础，耐药是肝细胞癌干细胞的特征之一。

【关键词】  肝细胞癌 异质性亚群细胞 多药耐药

    Abstract  Objective  To study the expression and significance of multidrug resistance-associated protein in human HCC heterogeneous subpopulations cells. Methods  ①Resistance of subpopulations cells (LCSC-1 and LCSC-2) to different chemotherapeutic drugs (ADM, VP-16, and DDP) and the IC50 values of each drug are measured using MTT method. ②Number of positive cells of MDR1, MRP, LRP, GST related to drug resistance are measured using flow cytometry, and the average level of expression of drug-resistant proteins of each subpopulations cells is calculated. Results ①Both subpopulations showed resistance against ADM, DDP, and VP-16.The IC50 values of these drugs to LCSC-2 are higher than those to LSCS-1(F=249.651).This result suggests a higher drug resistance of LCSC-2 subpopulation (P<0 .01). According to the results of statistical analysis, the inhibition rate of three drugs against LCSC-2 and LCSC-1 showed significant difference (P<0.01). ②The expression of MDR1 and MRP of LSCS-2 is significantly higher than that of LCSC-1 (P<0.01). A significantly difference of expression of LRP and GST is also observed (P<0.05). MDR1：（23.97±0.34）%vs（26.59±0.78）% ，MRP： （17.03±0.59）% vs（19.43±0.60）%，P<0.01；LRP（24.02±0.63）%vs （26.43±1.06）%，GST：（23.93±0.59）% vs （26.24±1.06）%，P<0.05.Conclusion The high level expression of MRP, LRP, GST, and MDR1 may be the molecular basis of the multiple drug resistance of human HCC subpopulations, and drug resistance is one of the characteristics of hepatic stem cell.

    Key words  Hepatocellular carcinomas  Heterogeneous subpopulations cells  Multiple drug resistance

    肿瘤细胞对细胞毒药物的耐药是影响肿瘤病人化疗疗效的一个重要因素， 人类多药耐药（multi-drug resistance，MDR）基因及其基因产物在肿瘤的多药耐药性中起着重要作用［１～3］。我们通过原代肝细胞癌细胞培养，克隆分离出了两种不同形态、不同生物学特性及不同成瘤能力的肝细胞癌亚群细胞。本研究通过检测化疗药物对这两种亚群细胞生长的抑制程度及多耐药基因在两种亚群细胞中的表达水平，来探讨HCC 组织中MDR基因表达与肿瘤的生物学特性和患者预后之间的关系，为临床预测化疗疗效、指导合理用药提供理论依据。

    1  材料与方法

    1.1  材料

    LCSC-1和LCSC-2亚群细胞：取材于同1例原发性肝细胞癌手术标本组织，通过原代细胞培养，采用有限稀释法克隆分离出经鉴定具有不同形态和生物学特征的两种细胞亚群，并且两种亚群细胞的致瘤性也不相同 ［4］。主要试剂：DMEM、胎牛血清（FBS）、谷氨酰胺、青霉素、链霉素为美国Gibco公司产品；胰蛋白酶为Sigma公司产品；MTT、小鼠抗MDR1抗体、小鼠抗MRP抗体、小鼠抗LRP抗体、小鼠抗GST抗体、FITC标记兔抗小鼠IgG抗体为北京中山公司产品。

    1.2  方法

    1.2.1  细胞培养方法

    人肝细胞癌LCSC-1、LCSC-2亚群细胞置于温度为37℃ 含5% CO2气体的培养箱中，选用含10%胎牛血清的DMEM培养基，常规培养两种亚群细胞。

    1.2.2  MTT法检测化疗药物对人肝癌细胞亚群生长的抑制效应

    1.2.2.1  实验分组：用不含血清的DMEM培养基倍比稀释化疗药物阿霉素（ADM）、顺铂（DDP）、足叶乙甙(VP-16)3种药物，参照各药临床用量的血峰浓度，以每种单药的不同浓度分组，分别加入，终浓度为：ADM 0.01、0.05、0.1、1.0、5.0 μg/ml，DDP 0.01、0.1、1、10、100 μg/ml，VP-16  0.1、1.0、10、100、200 μg/ml，上述药物每种浓度设3个复孔。同时设3个复孔不加药作为阴性对照。

    1.2.2.2  MTT法检测化疗药物对细胞生长的抑制作用 ：人肝细胞癌LCSC-1、LCSC-1亚群细胞，以每孔100 μl细胞悬液（含有1×105细胞）接种于96孔培养板，贴壁24 h后更换培养液。按实验分组分别处理细胞。加药组:肿瘤细胞悬液100 μL/孔，抗癌药10 μL/孔，培养液90 μl /孔。阴性对照组不加抗癌药，肿瘤细胞悬液100 μL/孔，培养液100 μL/孔；空白对照组只加培养液（200μL/孔）。24 h后更换为不含抗生素的培养液，加入MTT（5mg/ml）20 μl，继续培养4 h。翻板法弃上清液，每孔加入0.2 ml二甲亚砜(DMSO)，将培养板在微量振荡器上振荡5 min，酶标仪上以570 nm 波长测各孔的吸光光度值(A)。按公式计算细胞生长抑制率：细胞生长抑制率=( 1－实验组A值/空白对照组值)×100%。利用IC50计算软件分析药物作用LCSC-1、LCSC-2细胞后半数抑制浓度IC50。

    1.2.3  流式细胞仪分析耐药蛋白的表达

    （1）细胞培养 ：分别取对数生长期的LCSC-1、LCSC-2亚群细胞，用0.25%胰蛋白酶消化制成单细胞悬液，调整浓度为1×107/ml。(2) 实验取100 μl的细胞悬液分别加入5 ml的EP管中，每亚群细胞各种耐药蛋白检测设3个复管，每亚群细胞设立1同型对照；每管加入100 μl Reagent A(固定液)，轻轻振荡使细胞处于单细胞状态，室温孵育30 min。(3) 加入3 ml的PBS（含0.1%NaN3和5%FBS）轻轻振荡混匀。(4) 离心（800转/min,5min），沉淀细胞，弃上清液，剩约50 μl液体。(5) 在检测MDR1的EP管中加入10 μl抗MDR1抗体原液。(6)在检测MRP、LRP、GST的EP管中加入100 μl的Reagent B（破膜剂）和分别抗MRP、抗LRP、抗GST抗体原液10 μl，轻轻振荡、混匀。并用统一亚型抗体作阴性对照；37℃孵育60 min。(7) 用PBS液洗去未结合的一抗，加入荧光标记的抗小鼠或兔的二抗，37℃孵育30 min；PBS液洗去多余的二抗。(8) 加入3 ml的PBS轻轻振荡混匀。离心3 min（800转/分），去上清液。(9) 加鞘液(PBS)500 μl，细胞重悬后上机检测。或加入0.3～0.4 ml的1%多聚甲醛-0.01MPBS（ph7.4），振荡混匀后24 h内上机检测。(10) 流式细胞仪检测（激发光395 nm，发射光570 nm）：同型对照管调零后，每管测5000个细胞。

    1.3  统计学处理方法

    所有结果均以x±S表示，采用SPSS10.0软件进行t检验和析因方差分析进行组间比较，P<0.05为有统计学意义。

    2  结果

    2.1  LCSC-1、LCSC-2亚群细胞的药物敏感性

    根据测得的每种药物不同的细胞抑制率，利用IC50软件分析药物作用LCSC-1、LCSC-2细胞后半数抑制浓度IC50。两种细胞亚群对阿霉素（ADM）、顺铂（DDP）、足叶乙甙(VP-16)等药物都具有一定的耐药性, 统计学分析显示，3种药物对LCSC-2亚群细胞和LCSC-1亚群细胞产生抑制的抑制率差异明显不同 (P<0 .01) （见表1）。但LCSC-2亚群细胞对应这些化疗药的IC50值明显高于LCSC-1亚群细胞。提示LCSC-2亚群细胞较LCSC-1亚群细胞有较高耐药性。表1LCSC-1 细胞和LCSC-2 细胞对化疗药物的敏感性表1显示，不同药物影响下细胞IC50差异有显著意义，F＝1254.389，P<0.001。不同药物影响作用两两比较，LSD法，ADM与VP16、DDP与VP16两组药物差异均显著，P<0.001。ADM与DDP两组药物差异不显著，P＝0.07。不同细胞药物作用下IC50差异也有显著意义，F＝249.651，P<0.001。药物与细胞两个因素间存在交互效应，F＝163.181，P<0.001。

    2.2  MRP、LRP、GST、MDR1在LCSC-1和LCSC-2亚群细胞上的表达差异

    经流式细胞仪检测，4种耐药蛋白MDR1、MRP、LRP、GST在LCSC-1和LCSC-2两种亚群细胞上的表达有显著性差别（P<0 .05）。其中在LCSC-2亚群细胞上MDR1、MRP的表达较LCSC-1亚群细胞明显增高（P<0 .01）。详细结果见表2。

    3  讨论

    肝细胞癌对化疗药物产生耐药性是一种常见的临床现象，也是影响肝细胞癌综合疗效的原因之一。近年来，肿瘤多重耐药逐渐受到重视，肿瘤细胞对细胞毒药物的抵抗被认为是肿瘤化疗药物耐药的主要机制。研究证实：人类多药耐药基因及其基因产物在肿瘤的多药耐药性中起着重要作用，是肿瘤化疗疗效差的主要原因之一［5～8］。体外实验表明，抑制多药耐药基因的表达可以增加耐药细胞对化疗药物的敏感性［9,10］ 。有些肿瘤一开始即对化疗药物产生耐药，即内源性耐药；有些则是应用化疗药后产生耐药，即获得性耐药，两者有着相同的生物学基础。对那些无多药耐药基因表达的组织或器官发生的肿瘤，许多认为在化疗后和复发时，肿瘤才出现耐药基因的表达［11,12］。表2LCSC-1和LCSC-2细胞耐药相关蛋白MRP、LRP、GST、MDR1的荧光染色率情况

    各种干细胞包括造血干细胞，特有表达耐药蛋白如MDR1和ABC转运蛋白［13,14］，可以将细胞毒性药物排出至细胞以外，起到自我保护作用，免除毒性物质对细胞的损害，因而对化疗药物诱导凋亡不敏感［15,16］。如果肿瘤干细胞同样可能比其他肿瘤细胞高水平表达这些蛋白，那么肿瘤干细胞也许更具耐药性，这就可以解释化学转移肿瘤失败的原因。目前，化疗只是杀灭了已分化的具有有限增殖潜能的肿瘤细胞，使得肿瘤缩小，但是如果肿瘤干细胞存活，它们将持续肿瘤生长的过程。杀灭肿瘤干细胞也许能更有效地治疗转移癌。

    我们研究发现，肝细胞癌细胞自身存在耐药蛋白的表达，但不同的亚群耐药蛋白的表达水平不同，对化疗药物耐药程度也不相同，但都具有多药耐药性。LCSC-1细胞体外增殖快，倍增时间短，对化疗药物相对敏感；LCSC-2细胞亚群相对LCSC-1细胞亚群体外增殖慢，倍增时间长，对化疗药物相对不敏感。两亚群细胞对化疗药物敏感性程度存在明显的差别(P﹤0.05)。LCSC-1细胞耐药蛋白MRP、LRP、GST、MDR1的表达量较LCSC-2细胞低(P﹤0.05)，有统计学意义。肿瘤细胞耐药蛋白的表达水平与其对化疗药物的敏感性呈负相关性。我们同时发现，肝细胞癌组织中的细胞具有异质性，而具有克隆扩增能力的亚群细胞相对具有耐药性，这类细胞具有肝干细胞的相似表面标志。我们在前面实验中证实LCSC-2 亚群具有干细胞的特性［４］，本实验中又观察到其高表达耐药蛋白，证明耐药是干细胞的特征之一。肝细胞癌异质性亚群细胞耐药蛋白的异质性表达，可能介导了肿瘤细胞耐药异质性这一肿瘤的重要特性。

    LCSC-1和LCSC-2亚群细胞来源于同一个人。这种同一种病理类型同一个人来源的肝癌细胞未经化疗药物刺激诱导就存在耐药有关蛋白表达的差异，让我们联想到：这种差异在干细胞分化时就产生了，干细胞在不对称分裂时，不对称分裂产生细胞质、细胞器不均分布，分裂后形成两个不对称细胞，因此产生了生物学特性不同，耐药蛋白表达不同的异质性亚群细胞。这种理论也许解释了肿瘤患者在进行了化疗后肿瘤缩小或消失后但很快又复发的原因。因此，针对耐药肿瘤干细胞的靶向化疗可能是今后肿瘤治疗的方向。

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