地域差异与蛋氨酸合成酶基因多态性分布的相关性

【摘要】  目的 比较青海省与其他地区正常女性蛋氨酸合成酶基因的分布特点。方法 采用PCR - RFLP技术对125例正常人蛋氨酸合成酶基因进行扩增及图谱分析,结合既往发表的进行不同地区间的比较。结果 青海省正常女性中MS基因型以A /A 最多见, A /G次之。A /A 基因型频率为0.5760 、A /G为0.4160、G/G为0.0080。与其他地区相比较, MS基因型在青海省正常女性中的分布与国内其他地区人群中的分布差异显著。结论 蛋氨酸合成酶基因多态性在不同地区间的分布存在明显差异。

【关键词】  蛋氨酸合成酶 多态性 地域差异

    Abstract  Objective  To compare the distribution feature ofMethionine Synthase gene between QingHai Province and other regions. Methods The Methionise Synthase genotypes of 125 women in QingHaiProvince were determined by PCR - RFLP assay. Results Ms genotype frequency: A /A 0.5760, A /G 0.4160, G/G 0.0080.The genetypes frequencies of  Methionise Synthase in nomal feature of QingHai were different from those in other area in China.  Conclusion There has geographical variation in the Methionise Synthase Polymorphism in China.

    Key words  Methionine Synthase  Polymorphism  Geographical variation

    研究发现血清同型半胱氨酸(Hcy) 为心血管、脑血管、周围血管系统疾病及先天性畸形的独立危险因素,在相关疾病的发生、过程中起着重要的作用。近年来有关Hcy 与妊娠并发症的研究也取得了明显进展［1］ 。在妇产科领域, 有关Hcy与胎儿先天畸形、习惯性流产、先兆子痫及子宫内膜癌等疾病的关系也是近几年的研究热点。其中, 甲硫氨酸代谢相关酶或辅助因子缺乏可致同型半胱氨酸在血中蓄积, 而蛋氨酸合成酶(methionisesynthase, MS) 是Hcy再甲基化途径中的重要酶。我国人口众多,民族各异, 且背景复杂, 蛋氨酸合成酶基因的分布可能存在不同。本文利用聚合酶链式反应- 限制性片段长度多态性技术( PCR - RFLP) 对125例青海省正常女性蛋氨酸合成酶基因的多态性进行检测, 结果报告如下。

    1  资料与方法

    1.1  研究对象

    2005年6月至2006年9月在青海省妇幼保健院正常分娩的正常女性125 例, 排除生殖器官畸形、先天性遗传性疾病及血凝异常者。平均年龄25.67岁。 彼此之间无亲缘关系。

    1.2  引物的设计及合成

    MS A2756G所用引物参照文献［2］ , 正义链: 5′CAT GGA AGA ATA TGA AGA TAT TAGAC 3′; 反义链: 5′GAA CTA GAA GAC AGA AAT TCT CTA3′, 由大连宝生工程公司合成。

    1.3  研究方法

    1.3．1  DNA提取: 取外周血4 ml, 采用Qiagen公司DNA提取试剂盒, 按照试剂盒说明书进行提取。

    1.3.2  PCR 扩增: PCR 反应体系体积为25 μl, 10 μlDNA, 0.6 μl Taq 聚合酶, 14.4 μl MS 反应体系混合液。PCR反应条件: 94℃预变性5min, 94℃ 45 s, 55℃ 45 s,72℃ 60 s, 共35个循环。

    1.3.3  RFLP 分析

    1.3.3.1  HaeⅢ内切酶消化产物: 取17 μlPCR纯化产物, 2 μl Buffer, 1 μl Hae Ⅲ内切酶, 37℃水浴1 h。

    1.3.3.2  3%琼脂糖凝胶电泳分析酶切产物: 取20 μl酶切产物加入3%琼脂糖凝胶负极端的加样孔, 以溴酚蓝为指示剂, 溴化乙锭(EB) 为染色剂, 在90 V电压下电泳30 min左右, 然后在紫外分析仪上观察结果。

    1.3.4  将所得结果与文献报道的其他地区、种族人群MS基因分布特点进行比较［3，4］。

    1.4  统计学分析方法

    出正常人群中MS等位基因的频率,然后进行Hardy - weinberg遗传平衡定律检验。对不同地区间MS基因各亚型频率采用Kruskl-Wallis检验，等位基因频率采用χ2检验。

    2  结果

    2.1  等位基因的指定基因型的确定(见图1)

    MS基因片段PCR扩增产物长度为189 bp。MS A2756G突变的G等位基因PCR扩增产物经HaeⅢ消化后裂解成159 bp和30 bp两个片段。

    图1  MSA2765A等位基因产物琼脂糖凝胶电泳图

    ［M为DNA 分子量标准, 1、3、6、8 为A /A 基因型(野生型) ,

    4、7为A /G基因型(突变杂合子) , 泳道2为G/G基因型(突变纯合子)］

    2.2  青海省正常女性MS基因型及基因频率 （见表1）。   表1青海省正常女性MS基因及基因频率

    MS表型观察数预期数 n%n基因频率(% )A /A7257.676.832A 78.40A /G5241.642.336G 21.60G/G10.85.832表1可显示, MS各表型（A/A和A/G）的观察数与预期数比较,不存在显著差异(χ2 = 1.129， P = 0.288) ，说明其表型分布符合Hardy - Wein－berg遗传平衡定律, 也说明本研究中青海省正常女性MS的检测结果具有代表性。

    2.3  青海省正常人MS型频率与其他地区人群MS型频率的比较（见表2～3）表2青海省正常人MS基因型频率与其他地区人群MS型频率的比较表3青海省正常人MS基因频率与其他地区人群MS型频率的比较表2和表3可显示,  青海省正常女性中MS基因型以A /A最多见, A /G次之。青海省与湖南省、广东省的基因型频率相比,有显著性差异(χ2=23.672， P<0.001)。青海省与广东的基因型频率相比,两者有显著性差异( χ2=21.776， P<0.001 )；青海省与广东的基因频率相比两者有显著性差异(χ2=14.189， P<0.001 )； 青海省与湖南的基因频率相比,两者有显著性差异(χ2=11.970， P=0.01)。三个区域总比较有显著性差异(χ2=19.038， P<0.001 )。

    3  讨论

    目前多数观点认为当Hcy 水平升高时,容易被氧化生成同型半胱氨酸化合物,同时产生过氧化氢和超氧离子自由基,导致血管内皮细胞损伤和血管平滑肌细胞增殖。由于内皮细胞长期暴露于较高水平的Hcy 中,导致细胞释放一氧化氮产物减少,内皮细胞介导的血小板抑制作用减弱,血小板粘附聚集,而且Hcy 晶体可以为血管内凝血因子的接触活化过程提供“致病条件”,影响子宫胎盘血流,导致胎儿从母体摄入营养物质和O2 受限,影响胎儿生长发育［5，6］。蛋氨酸合成酶对于维持蛋氨酸和四氢叶酸在细胞内水平及维持同型半胱氨酸在无毒性浓度水平有重要作用［7］。人群中存在的不同MS基因型有可能导致不同个体中MS的转录表达水平存在一定差异。这一推测目前已被一些研究证实: 在对高同型半胱氨酸血症患者进行的MS基因多态性的研究中发现, 不同的MS基因型与不同个体中MS的表达显著相关。Morita［8］认为MSD919G多态性与血浆Hcy浓度显著相关, 基因型A /A最易导致MS活性缺陷从而引起高Hcy血症。

    我们的研究显示, 青海省人群女性中ＭＳ基因型以A /A 型居多,A /G型次之, G/G型最少。与其他地区人群的研究结果相比, 青海省正常人群的G等位基因频率明显高于其他地区正常人群, A等位基因频率明显低于其他地区正常人群(P < 0.05) 。 我们的研究表明MS基因多态性的分布在不同地区间存在差异。

【】
  ［1］ E. Nissinen1, H. Nissinen1, et al.The COMT inhibitor, entacapone, reduces levodopa-inducedelevations in plasma homocysteine in healthy adult rats［J］.J Neural Transm (2005) 112: 1213-1221

［2］C.Konrad, MD ， G. A. Müller ，G.Kuhlenbmer, MD,et al. Plasma homocysteine, MTHFR C677T,CBS 844ins68bp, and MTHFD1 G1958Apolymorphisms in spontaneous cervicalartery dissections［J］.J Neurol ，2004，251 : 1242-1248

［3］Zhang G, Dai C. Gene polymorphism of homocysteinemetabolism -related enzymes in Chinese patientswith occlusive coronary artery orcerebral vascular disease［J］.Thromb Res, 2001 , 104(3) : 187 - 195

［4］李耀明, 梁剑宁.广东汉族人蛋氨酸合成酶基因多态性［J］.优生与遗传杂志, 2004, 12 (4) : 38 - 39

［5］高树生,洪建琼. 高同型半胱氨酸血症与妊高征［J］. 妇产科进展,2002 ,11(6) :451-4521

［6］Scholl To ,Johnson WG. Folic acid :influence on the outcome of pregnancy［J］. AmJ Clin Nutr ,2000 ,71 :1295-13031

［7］N. Takamura,M.D., PhD. Abnormal folic acid-homocysteinemetabolism as maternal risk factorsfor Down syndrome in Japan ［J］.J Nutr ，2004， 43 : 285-287

［8］Brown CA, McKinney KQ, Kaufman JS, et al. A common polymorphism in methionine synthase reductase increase risk of prematurecornary artery disease［J］ .J Cardiovasc Risk, 2000, 7 ( 3 ) :197 - 200