PMA联合钙离子载体诱导K562细胞向树突状细胞分化

【摘要】  目的 探讨卟啉醇肉豆蔻酸乙酸酯（PMA）联合钙离子载体（CI）诱导K562细胞向树突状细胞（DC）分化的作用。方法 对数生长期的K562细胞在含PMA和CI的培养液中培养96 h后，倒置相差显微镜下观察细胞形态，用流式细胞仪检测细胞表型，用MTT法检测其刺激淋巴细胞增殖的能力。 结果 PMA联合CI组细胞形态发生明显变化，表面出现许多细小的突起，细胞表面CD83、CD86、CD80、CD40、HLA?DR和CD1a表达上调，并且可以刺激淋巴细胞的增殖反应。 结论 PMA联合CI可以有效地使K562细胞向DC分化。

【关键词】  K562细胞 树突细胞 十四酰佛波乙酯 钙通道 离子载体

    ABSTRACT:  Objective   To explore the effect of PMA (phorbol myristate acetate) and calcium ionophore (CI) in inducing the differentiation of leukemia cell line K562 into activated dendritic cells (DC).  Methods  K562 cells were cultured in a common medium containing CI (A23187) and PMA for 96 h.  The cell morphology was observed under the light phase contrast microscope and the electronic microscope.  The viability rate of K562 cells cultured in each group was examined by the trypan blue staining.  The immunologic phenotypes were analyzed by flow cytometry.  The proliferation reaction of lymphocyte cells was detected by MTT colorimetry.  Results  After 96 h treatment with A23187 (375ug/ml) and PMA (10 μg/mL), the cells exhibited the characteristic DC morphology, CD83, CD86, CD80, CD40 and HLA?DR, CD1a expression was upregulated and the cells were found to be able to strongly stimulate the proliferation of allogeneic T cells when cultured with them.  Conclusion  CI in combination with PMA can induce K562 cells to differentiate into DCs.

    KEY WORDS:  K562 cells; dendritic cells; tetradecanoylphorbol acetate; calcium channels; ionophores

    福建医科大学学报  2008年7月  第42卷第4期曾晓明等：PMA联合钙离子载体诱导K562细胞向树突状细胞分化树突状细胞（DC）是体内最强的抗原提呈细胞（APC），来源于髓系祖细胞。在白血病的细胞中，DC的祖细胞和白血病细胞同样来源于骨髓造血干细胞，因此可以刺激原始细胞分化成DC，直接呈递完整的白血病抗原，从而刺激T细胞产生抗肿瘤效应 [1]。笔者观察了卟啉醇肉豆蔻酸乙酸酯(phorbol myristate acetate，PMA)联合钙离子载体（calcium ionorphore，CI）诱导K562细胞向DC分化的作用,探讨运用细胞株进行抗白血病免疫的可行性。

　　1  材料与方法

　　1.1  材料 

　　K562细胞株由福建医科大学药研究所馈赠。CI（A23187）、PMA为Sigma公司产品。RPMI 1640干粉为美国Gibco公司产品。胎牛血清(FCS)为杭州四季青生物制品公司产品。异硫氰酸荧光素（FITC）标记的抗HLA?DR、CD80单抗，PE标记的抗CD86，CD83，CD40和CD1a单抗及同亚型对照抗体（鼠抗人），均为美国eBioscience公司产品。丝裂霉素C为上海Roche公司产品。6孔培养板、96孔培养板均为Coasta公司产品。L?谷氨酰胺、MTT及台盼蓝制剂为厦门泰京生物工程有限公司产品，人淋巴细胞分离液为天津市灏洋生物制品科技有限责任公司产品。

　　1.2  方法

　　1.2.1  K562细胞培养及形态观察 

　　（1）取对数生长期的K562细胞，以完全RPMI 1640培养基（加入10％FCS，10 mmol/L L?谷氨酰胺）悬浮，以1×106 mL-1接种于6孔板中，每孔2 mL，分4组。PMA+CI组：加入PMA和CI,使PMA最终浓度为10 ng/mL，CI最终浓度为 375 ng/mL；PMA组：只加入PMA，PMA最终浓度为 10 ng/mL；CI组：只加入CI，CI最终浓度为375 ng/mL；对照组：只加培养基。每组细胞为一板（n=6），37 ℃、体积分数为0.05的CO2培养箱中培养，隔天半液换量。实验组（包括PMA+CI组、PMA组及CI组）另外加入半量新鲜试剂，对照组只补充新鲜培养基。培养96 h后收获细胞。（2）形态观察。收获4组细胞，在倒置显微镜下观察细胞形态。（3）细胞活率测定。收获各实验组的K562细胞，按台盼蓝1滴、K562细胞9滴的比例混合均匀，<30 s滴于细胞计数板上，显微镜下计数。

    细胞活率=不染色细胞/（染色细胞＋不染色细胞）×100％

　　1.2.2  电镜观察 

　　收获的细胞经离心沉淀，用3.0%戊二醛和1.0%饿酸固定，经乙醇梯度脱水，超薄切片置透射电镜观察（由福建医科大学电镜室协助完成）。

　　1.2.3  流式细胞仪检测 

　　收获的细胞用PBS洗涤2次后重悬成体积100 μL，加入FITC标记的抗HLA?DR和CD80单抗，PE标记的抗CD86、CD83，CD40和CD1a单抗及同亚型对照抗体20 μL，室温孵育30 min，PBS洗涤3次，用流式细胞仪（BECKMAN COULTER Epics XL）检测。

　　1.3  同种混合淋巴细胞反应

　　1.3.1  人外周血淋巴细胞的分离和培养 

　　抽取健康人外周血20 mL，用淋巴细胞分离液密度梯度离心分离，吸取中间层单个核细胞层，洗涤3次，用1640完全培养基重悬浮，于6孔板37 ℃、体积分数为0.05的CO2培养4 h后，轻轻吸取未贴壁细胞，为外周血淋巴细胞，备用。

　　1.3.2  MTT比色法测定 

　　取PMA+CI组培养96 h后收获的K562细胞（刺激细胞），用PBS洗涤2次，用含10％的FCS的RPMI 1640培养基悬浮，调整细胞浓度5×105 mL-1，加入终浓度为25 μg/mL的丝裂霉素C，37 ℃、体积分数为0.05的CO2孵育30 min去增殖后，用PBS洗涤2次，分别调整细胞浓度为5×103，2.5×103，1×103 mL-1，与上述淋巴细胞（效应细胞，浓度为5×105 mL-1）共同接种于96孔板中，每孔终体积为180 μL，刺激细胞和效应细胞比分别为1∶100，1∶200，1∶500，每孔设3个复孔。同时，将没有经过实验处理的K562细胞（对照细胞）以同样的方法和淋巴细胞接种于96孔板内。另设相同浓度的单独效应细胞（淋巴细胞）对照孔及单独DC对照组（空白1）、单独靶细胞（K562细胞）对照组（空白2）对照孔，每孔同样设3个复孔，在37 ℃、体积分数为0.05的CO2培养箱中培养96 h，在培养结束前4 h每孔加入MTT 20 μL，培养结束后离心弃上清，加入二甲基亚砜(DMSO)150 μL，酶标仪于490 nm波长检测吸光度，实验孔和未处理孔增殖倍数。

    实验孔增殖倍数=（实验组孔-空白1）/淋巴细胞对照孔
   
　　对照孔增殖倍数=（对照细胞孔-空白2）/淋巴细胞对照孔

　　2  结  果

　　2.1  显微镜观察 

　　PMA+CI组的细胞变大，表面出现许多细小的突起，部分细胞死亡，细胞数与对照组相比有所减少。PMA组的细胞也变大，但突起不明显，死亡的细胞较多，数量明显减少。CI组细胞稍变大，但没有发现细胞突起，也没有引起细胞死亡，数量上与对照组也没有很大的差别（图1）。

　　2.2  细胞活率 

　　各实验组的细胞活率：PMA+CI组为67.1%，PMA组为35.1%，CI组为89.7%，对照组为99%。

　　2.3  电镜观察 

　　PMA+CI组的细胞体积增大，形状不规则，细胞质有突起，细胞核清晰，线粒体丰富，粗面内质网发达，可见溶酶体（图2）。

　　2.4  流式细胞仪检测 

　　与对照组比较，PMA+CI组细胞表面分子CD80、CD83、CD83、CD40L、CD1a、HLA?DR都有明显的表达上调（图3）。而单用PMA和单用CI组与对照组比较无明显不同（表1）。表 1  K562细胞经PMA联合CI诱导96 h后的细胞表型（略）

　　2.5  混合淋巴细胞反应 

　　PMA+CI组与对照组的淋巴细胞增殖反应见图4。PMA+CI组在DC∶淋巴细胞为1∶100，1∶200，1∶500均可见淋巴细胞增殖反应，以1∶100时最强，达200％以上，而对照组的增殖倍数都没有超过100％，即淋巴细胞没有发生增殖反应。   

　　形状不规则，细胞质有突起，细胞核清晰，线粒体丰富，粗面内质网发达，可见溶酶体.

　　3  讨  论

    Choudhury等采用慢性粒细胞白血病（CML）患者的骨髓细胞，经体外诱导成DC，这些DC带有CML细胞的特异性抗原bcr/abl融合基因，可以激活T细胞产生特异性的细胞毒性T淋巴细胞（CTL）效应，对白血病细胞进行杀伤溶解[1]。本实验室也曾采集CML患者的骨髓细胞在体外诱导可转化为DC，这种DC同样表达肿瘤抗原，在同CML骨髓细胞共同培养后，可以使CML肿瘤细胞减少，为CML的体外净化提供了一条可能的途径[2]。

    用白血病细胞株也可以在体外诱导分化成DC[2?3]，白血病细胞株来源方便，同质性好。但研究表明，白血病细胞诱导生成的DC表面分子表达不充分，分析认为，可能由于不同的刺激因子只是部分激活了DC分化的机制，不能全面诱导DC成熟。Mohamed等分析了不同的刺激因子（细胞因子、CI、PMA）诱导肿瘤细胞生成DC 的作用认为，比起细胞因子，CI和PMA可以使细胞分化得更为成熟。可能是经由细胞因子介导细胞分化的信号传导途径可能在肿瘤细胞中存在缺陷，而CI和PMA是直接刺激下游信号的介质，可以绕过这些途径而引起细胞的分化[4]。

    笔者采用PMA联合CI诱导K562细胞，经过4 d的培养，观察到细胞周围有细小的突起，检测其表达免疫表型CD80、CD86、CD83、CD40、MHC?I/Ⅱ分子，发现比对照组有明显的上调。混合淋巴细胞培养也显示，比对照组具有明显的淋巴细胞增殖效应。单用CI诱导K562细胞，没有发现有形态上的变化，其免疫表型和对照组也没有很大的区别，这也和本实验室以往的研究结果一致[5]。虽然采用CI已证实可以在体外使CML患者的外周血或骨髓单个核细胞分化成具有抗原提呈功能的DC[6]，但单用CI看来不足以使K562细胞分化。可能的解释是，K562是增殖旺盛的细胞株，需要更强的诱导分化刺激。单用PMA的实验结果是细胞死亡率比较高，和Mohamed等实验结果一致[5]，可能由于PMA是一种化学诱导剂，对细胞的毒性作用比较大。本实验在淋巴细胞增殖反应上采用了比其他实验更低的效靶比（1∶100，1∶200，1∶500），同样发现有相当强烈的增殖效应，说明采用这种方法诱导生成的DC具有很强的刺激淋巴细胞增殖的能力。

    笔者认为，采用PMA联合CI诱导K562细胞，可以使其获得典型DC的形态特征、免疫表型和刺激同种混合淋巴细胞增殖的功能，使这种类DC的细胞更加具有成熟DC的特征，为临床上获取DC进行免疫治疗提供了一种更加方便和可靠的方法，有可能成为抗白血病治疗新的手段，当然，K562细胞作为肿瘤细胞，其应用的安全性还需要进一步的研究和探讨。

【】
  　　[1] Choudhury A,Gajewski J L,Liang J C, et al. Use of leukemic dendritic cells for the generation of antileukemic cellular cytotoxicity against Philadelphia chromosome?positive chronic myelogenous leukemia[J]. Blood， 1997,89(4):1133?1142.

　　[2] 陈君敏,陈志哲,魏秀妹. 自体树突状细胞用于慢性粒细胞白血病骨髓净化的初步研究[J]. 福建医科大学学报, 2001,35(1):36?39.

　　[3] Lindner I,Kharfan?Dabaja M A,Ayala E, et al. Induced dendritic cell differentiation of chronic myeloid leukemia blasts is associated with down?regulation of BCR?ABL[J]. J Immunol, 2003,171(4):1780?1791.

　　[4] Kharfan?Dabaja M,Ayala E,Lindner I, et al. Differentiation of acute and chronic myeloid leukemic blasts into the dendritic cell lineage: analysis of various differentiation?inducing signals[J]. Cancer Immunol Immunother, 2005,54(1):25?36.

　　[5] 郜 峰,陈君敏,叶德富,等. 钙离子载体上调K562细胞B7分子表达[J]. 免疫学杂志, 2006,22(7):612?614，618.

　　[6] Koski G K,Schwartz G N,Weng D E, et al. Calcium mobilization in human myeloid cells results in acquisition of individual dendritic cell?like characteristics through discrete signaling pathways[J]. J Immunol, 1999,163(1):82?92.