吡格列酮对游离脂肪酸介导的βTc3细胞凋亡的干预作用
【摘要】 目的 研究吡格列酮对游离脂肪酸(FFA)诱导的小鼠胰岛βTc3细胞凋亡的影响及其作用机制。 方法 以βTc3细胞为研究对象,分为对照组及FFA组(0.25,0.5,1.0 mmol/L)。检测不同浓度FFA干预后βTc3细胞的增殖抑制率、细胞周期、细胞凋亡率;检测吡格列酮对FFA诱导的βTc3细胞凋亡的干预作用。 结果 FFA干预后的βTc3细胞增殖抑制率随FFA作用时间延长、浓度增加而进行性增加。各浓度FFA干预24 h后βTc3细胞周期于G1/S检测点明显阻滞,凋亡细胞比例增加。吡格列酮干预FFA诱导的βTc3细胞后24 h,βTc3细胞周期阻滞减少,凋亡细胞比例明显减少。 结论 FFA水平异常不利于胰岛βTc3细胞生存,并可诱导βTc3细胞凋亡;吡格列酮有助于维护在FFA诱导下的胰岛βTc3细胞的生存能力,并避免或减少其凋亡。
【关键词】 噻唑烷二酮类 脂肪酸类 菲酯化 胰岛 糖尿病 2型 细胞凋亡
ABSTRACT: Objective To investigate the effects of pioglitazone on FFA?induced apoptosis of βTc3 cell, a pancreatic β?cell line in vitro. Methods βTc3 was subject to different treatments with a blank and three kind concentrations of FFA, that were 0.25, 0.5 and 1.0 mmol/L FFA. The Method of MTT was used to measure the proliferation inhibition rates for successive three days after FFA intervention. The changes of cell cycle were detected 24 hours after treatment by a flow cytometry. TUNEL was used to determine the apoptosis rate of cells 24 hours after treatment. TUNEL and flow cytometry were used to determine intervention effect of Pioglitazone on the apoptosis of βTc3 cell induced by FFA. Results Inhibition of βTc3 was increased with prolonged treatment of FFA and increased FFA concentrations. Flow cytometry analysis showed that cell cycle of βTc3 cell treated with FFA of all the concentration was blocked in phase of G1/S. The percentage of βTc3 cell apoptosis substantially increased due to FFA treatment. No obvious abnormal change of cell cycle of βTc3 cell and a substantially decrease of percentage of apoptosis cells after pioglitazone intervention. Conclusion Abnormal FFA level is extremely harmful for survival of βTc3 cell cultured in vitro, but pioglitazone could maintain the surviving ability of insulin βTc3 cell damaged by FFA.
KEY WORDS: thiazolidinediones; PPAR gamma; fatty acids,nonesterified; diabetes mellitus,type 2; apoptosis
福建医科大学学报 2008年7月 第42卷第4期程惠希等：吡格列酮对游离脂肪酸介导的βTc3细胞凋亡的干预作用2型糖尿病是糖尿病的主要类型,但其发病机制尚未阐明。迄今的研究显示,胰岛β细胞功能缺陷和胰岛素抵抗是2型糖尿病主要病理生理基础,而游离脂肪酸(free fatty acids,FFA)水平异常可能为重要的致病因素,长期暴露于高FFA可引起人和鼠胰岛β细胞脂质过载,细胞增殖下调和凋亡增加,胰岛素分泌减少[1?3]。
过氧化物酶体增殖物激活受体(peroxisome proliferators activator receptors gamma,PPAR)是一类由配体激活的核内受体转录因子超家族成员,存在3种亚型,即PPAR?α、PPAR?β和PPAR?γ。笔者既往研究显示,PPAR?γ高表达可保护胰岛βTC3细胞免于FFA介导的损伤[4]。噻唑烷二酮类药物(thiazolidinedione compounds,TZD)是PPAR?γ的高亲和力配体,也是重要的抗糖尿病药物。笔者应用TZD类药物——吡格列酮干预FFA对βTC3细胞的有害影响,以期进一步分析FFA水平异常介导β细胞损害的机制及为吡格列酮的抗糖尿病作用提供。
1 材料与方法
1.1 材料
βTC3细胞源自转基因小鼠的胰岛素瘤细胞(福建医科大学分子医学中心惠赠);RPMI 1640培养基(美国Gibco公司)培养,内含10％小牛血清、2 mmol/L的L?谷氨酰胺、100 U/mL青霉素、100 μg/mL链霉素;油酸、棕榈酸(美国Sigma公司);吡格列酮(江苏德源药业有限公司);甲基偶氮唑蓝(MTT,厦门泰京生物有限公司);TUNEL试剂盒(瑞士Roche公司)。
1.2 方法
1.2.1 FFA制备
FFA贮备液中油酸与棕榈酸的比例为2∶1。溶解所需剂量的油酸和棕榈酸于99%乙醇10 mL,振摇1 h。每10 mmol/L FFA加入0.4 g/mL NaOH 40 μL,混匀,置于通风橱中过夜干燥。后加入蒸馏水10 mL,加热溶液至透明皂液样时,加入10%冷小牛血清40 mL,混匀。经0.22 μm CA过滤器过滤消毒后贮存于-20 ℃备用。
1.2.2 吡格列酮配制
吡格列酮5 mg用二甲亚砜(DMSO)溶解,再用DMSO溶液稀释配置成1 mmol/L的母液,过滤除菌,4 ℃保存,使用前用RPMI 1640培养基稀释,培养基中DMSO终浓度≤0.01％。
1.2.3 MTT法测定FFA对βTc3细胞的影响
取对数生长期的βTc3细胞接种于96孔培养板,温育24 h后吸去上清液,每孔加含10%小牛血清的RPMI 1640培养基180 μL。继续温育24 h后,药物组每孔加不同浓度的 FFA 20 μL,使其工作浓度分别为0.25,0.5,1.0 mmol/L,对照组加等量的含10%小牛血清的RPMI 1640培养基。反应结束前4 h吸去培养上清液,每孔加5 mg/mL的MTT溶液50 mL。继续培养4 h后,吸去MTT溶液,每孔加入DMSO 150 μL充分溶解MTT还原产物。于酶标仪上检测490 nm波长光密度值(D)。测定FFA干预后12,24,48 h的细胞D值,绘制各组细胞生长曲线,取各组平均值细胞生长抑制率。
1.2.4 流式细胞仪测定βTc3细胞周期
取对数生长期的βTc3细胞接种于6孔培养板,分别设置对照组、A组(FFA 0.25 mmol/L)、B组(FFA 0.5 mmol/L)、C组(FFA 1 mmol/L)。培养细胞24 h后以0.25％的胰蛋白酶充分消化细胞,500～1 000 r/min离心5 min,弃去培养液。PBS 3 mL洗涤1次,离心去PBS,加入预冷的70％乙醇固定,4 ℃ 1 h。离心弃去固定液,PBS 3 mL重悬5 min。400目筛网过滤1次,500～1 000 r/min离心5 min,弃去PBS。用碘化丙啶1 mL染液,4 ℃避光30 min。于流式细胞仪上检测各组细胞周期。
1.2.5 TUNEL法检测细胞凋亡
(1)培养细胞并加不同浓度的FFA,24 h后经空气干燥后用4%多聚甲醛溶液固定,PBS洗片后,与0.3%H2O2甲醇溶液室温孵育。(2)PBS洗片,与通透液在冰浴中孵育2 min。(3)PBS冲洗2次,滴加TUNEL反应混合液50 μL,对照组以PBS缓冲液取代TUNEL反应混合溶液,在湿盒中37 ℃孵育60 min。(4)PBS冲洗3次,加入转化剂POD 50 μL,在湿盒中37 ℃孵育30 min。PBS冲洗3次,加入DAB底物溶液,室温孵育10 min。DAB显色凋亡阳性细胞后(凋亡阳性细胞核呈棕黄色),苏木精对比染色阴性细胞核。每份样品于高倍镜下随机选取5个视野,计数100个细胞核,凋亡细胞百分率。
凋亡指数(%)=(凋亡细胞数/细胞总数)×100%
1.2.6 流式细胞仪检测吡格列酮对细胞凋亡的干预作用
取对数生长期的βTc3细胞接种于6孔培养板,设置FFA 1 mmol/L组和100 μmol/L吡格列酮+FFA 1 mmol/L组。培养细胞24 h后以0.25％胰蛋白酶充分消化细胞,离心、PBS洗涤、离心,收集细胞,PBS洗涤后过滤,于流式细胞仪上检测各组细胞周期。
1.2.7 TUNEL法检测吡格列酮对细胞凋亡的干预作用
培养细胞,设置FFA 1 mmol/L组和吡格列酮100 μmol/L+FFA 1 mmol/L组,24 h后同前述方法检测βTc3细胞凋亡,计算凋亡细胞百分率。
1.3 统计学处理
实验数据以x±s表示,SPSS 10.0软件处理数据。组间差异采用方差分析,各实验组与对照组比较采用Dunnett?t检验,P<0.05为差别有统计学意义。
2 结 果
2.1 MTT分析FFA诱导的βTc3细胞的增殖活性变化
不同浓度的FFA作用于βTc3细胞12,24,48 h后,MTT法测定各组细胞D值。与对照组比较,FFA 0.25 mmol/L诱导12 h后的细胞增殖活性无明显降低(P＞0.05);0.5 mmol/L和1 mmol/L FFA诱导12 h后的细胞增殖活性明显降低(P<0.05);不同浓度 FFA诱导24,48 h后的细胞增殖活性与对照组比较均明显降低,细胞增殖抑制率上升。FFA对于βTc3细胞的增殖抑制作用具有明显的时间和浓度依赖性(表1)。表1 FFA诱导后MTT检测的增殖抑制率（略）
2.2 流式细胞仪测定FFA诱导后24 h细胞周期
0.25,0.5,1 mmol/L FFA作用于βTc3细胞24 h后,各浓度FFA对于细胞周期具有明显的G1/S阻滞作用。随浓度增加,G1期(DNA合成前期)细胞明显增多,S期(DNA合成期)细胞明显减少,FFA阻滞细胞周期具有明显的浓度依赖性。与对照组比较,差别有统计学意义(表2)。1 mmol/L FFA诱导的βTc3凋亡明显,加入100 μmol/L的吡格列酮干预1 mmol/L的FFA诱导的βTc3细胞24 h后,吡格列酮干预组的βTc3细胞的细胞周期的G1/S阻滞作用明显减少,与未干预组比较,差别有统计学意义(P<0.05,表3)。表2 FFA诱导24h后βTc3细胞周期（略）表3 吡格列酮和FFA对βTc3细胞周期的影响（略）
2.3 TUNEL法检测FFA诱导的细胞凋亡
0.25,0.5,1 mmol/L的FFA作用于βTc3细胞24 h后,TUNEL实验表明上述各浓度FFA均可诱导βTc3细胞凋亡,且呈明显的浓度依赖性,与对照组相比差别有统计学意义。加入100 μmol/L的吡格列酮干预1 mmol/L的FFA诱导的βTc3细胞24 h后,βTc3细胞的凋亡细胞比例(40.30±3.40）%,较未干预组(77.20±2.30）%明显减少,差别有统计学意义(P<0.05,图1)。
3 讨 论
近年对2型糖尿病发病机制的研究已取得很大进展,多数学者认为胰岛β细胞的进行性衰竭是2型糖尿病的发生的决定因素。但β细胞功能缺陷的机制目前尚未完全阐明。肥胖者脂肪组织分解产生的FFA明显增加,而FFA不仅参与了胰岛素抵抗的发生,也被证实可损害β细胞功能,并可导致β细胞凋亡[2,5]。PPAR?γ是脂肪细胞分化的重要调节因子,也是新一代的抗糖尿病药物TZD的作用靶分子。已知FFA可作为配体与PPAR?γ结合,激活PPAR?γ,使Caspases蛋白表达增高,引起细胞凋亡[2,6],但具体途径不明。显示,β细胞也有PPAR?γ表达。笔者前期研究表明,高水平的FFA对βTc3细胞的生存能力有明显的抑制作用,表现为细胞生存率降低或出现凋亡,进一步提示FFA对胰岛β细胞的损害可能是2型糖尿病患者胰岛β细胞功能失代偿的原因之一。
本研究中,笔者应用PPAR?γ的激动剂——吡格列酮干预FFA对βTc3细胞的损害,结果显示具有明显的保护细胞免于FFA的损害,可使βTc3细胞的凋亡明显减少,提示吡格列酮与PPAR?γ结合后,抑制FFA诱导的β细胞凋亡,表明FFA与PPAR间的反应可能参与胰岛β细胞的凋亡。TZD还也可限制β细胞内TG的堆积,改善这些组织的功能,并可使β细胞葡萄糖刺激的胰岛素分泌有所恢复,继而预防β细胞的凋亡。TZD可增加前脂肪细胞的分化和成熟,增加脂肪细胞的数量,储存更多的TG,减少循环中FFA水平及非脂肪组织FFA的流入,还可以降低非脂肪组织内原有的脂肪高合成代谢,其关键酶表达下调,从而降低细胞内TG含量,对TG在β细胞内堆积引起的β细胞功能障碍起到保护作用[7]。笔者既往研究发现,TZD可抑制NF?κB的活性保护β细胞免于TNF?α诱导的细胞凋亡[8],此次研究显示吡格列酮保护βTc3细胞免于FFA诱导的细胞凋亡，是否与抑制NF?κB的活性有关值得探讨。
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