小鼠早期胚发育全程微分干涉差显微观察

【摘要】  目的 对小鼠早期胚发育全程进行系统的微分干涉差显微观察并制成图谱。 方法 通过体外受精和体内受精方法获得小鼠卵母细胞和早期胚胎,利用倒置微分干涉差显微镜观察排卵前卵母细胞至扩展囊胚的早期胚发育全过程,数码显微摄影系统拍照。 结果 记录排卵前卵母细胞至扩展囊胚的小鼠早期胚发育全过程,制成微分干涉差显微图谱。 结论 微分干涉差显微镜观察卵母细胞和各阶段早期胚,立体感强，对比度适当,可以准确生动地显示微细结构,所形成的图谱可供胚胎培养与操作借鉴。

【关键词】  小鼠; 胚胎发育; 微分干涉差显微术

    ABSTRACT:  Objective  To observe systematically and set up the atlas of the whole developmental process of mouse preimplantation embryonic oocyte with differential interference contrast(DIC) microscopy(DIC).  Methods  Mouse oocytes and preimplantation embryos were derived from in vitro or in vivo fertilization.  The full developmental stages from preovulatory oocyte to expanded blastocyst of mouse embryos were observed by inverted DIC microscope, and photos were taken by digital microphotography.  Results  A DIC atlas of preimplantation embryos in full developmental stages was formed from preovulatory oocyte to expanded blastocyst.  Conclusion  DIC technique offered a stereo and fine image of cell/embryo in different stages.  The atlas made from this observation can be used for reference to those who needs to culture and manipulate mouse embryos.

    KEY WORDS:  mice; embryonic development; differential intereference constrast microscopy

    随着功能基因组学时代的到来,转基因小鼠、基因打靶(尤其是其中的基因敲除)小鼠、克隆小鼠技术和小鼠胚胎干细胞工程等,已经成为生命各前沿领域普遍采用的研究手段。在这些研究中,使用微分干涉差显微镜(differential interference contrast microscope,DIC)技术，对小鼠的早期胚进行细致的观察与操作是不可或缺的关键步骤［1］。笔者对小鼠体内发育或体外受精形成的早期胚各个阶段,用DIC显微镜进行系统观察并实时摄影,形成小鼠早期胚发育全过程图谱,为推广小鼠胚胎操作技术,促进基因功能研究提供实用的基础资料。

　　1  材料与方法

　　1.1  材料

　　1.1.1  动物

　　SPF级ICR小鼠,3周龄雌鼠,体质量15~18 g;性成熟雌鼠、雄鼠,体质量30~35 g［上海斯莱克实验动物有限责任公司,许可证号:SCXK(沪)2003-0003］,雌鼠52只,雄鼠12只。

　　1.1.2  主要试剂 

　　孕马血清（PMSG 1 000 IU/瓶,杭州动物药品厂);人绒毛膜促性腺激素（hCG 1 000 IU/瓶）,丽珠集团丽珠制药厂);M2培养基、M16培养基:参照［1］配制;KSOM＋AA培养基［2］(EmbryoMax,美国Chemicon公司);矿物油(Embryo Culture Tested,M-8410,美国Sigma公司)。

　　1.1.3  主要仪器 

　　倒置显微操作系统(TE-2000U型,日本Nikon公司);数码显微摄影系统(DP-70型,日本Olympus公司);三气培养箱(3131型,美国Thermo公司);体视显微镜(SZX7型,日本Olympus公司);双人单面净化工作台(SW-CJ-1Cu型,苏州净化设备有限公司)。

　　1.2  方法

　　1.2.1  小鼠超数排卵 

　　选用3周或性成熟ICR雌鼠为供卵/胚鼠。用于体外受精的小鼠于第1天17-18时腹腔注射PMSG 5.0 IU,48 h后腹腔注射hCG 5.0 IU,待用;用于体内受精的ICR雌鼠于第1天12时左右腹腔注射PMSG 5.0 IU,48 h后腹腔注射hCG 5.0 IU,熄灯(20时)前与性成熟雄鼠合笼,交配,第4天8时左右检查雌鼠,选有阴道栓者待用。

　　1.2.2  排卵前卵母细胞采集与处理 

　　选取经超数排卵后而未受精的雌鼠,断颈处死,从腰背部打开腹腔,取出卵巢,在M2培养液中用解剖针刺破卵巢上突出的卵泡,释放卵泡内的卵丘团,用20 μL移液器吹吸,洗净组织碎片;收集卵丘团,用自制的玻璃微吸管(D≈120~160 μm)反复吹吸,去除卵丘颗粒细胞;置于体积分数为0.05的CO2、37 ℃预平衡的KSOM液滴中,覆盖石蜡油,立即观察。

　　1.2.3  体内受精小鼠早期胚采集与培养 

　　于第4天10时左右(合笼交配0.5 d)采集体内受精的受精卵。选取超数排卵并合笼后有阴道栓的雌鼠,断颈处死,打开腹腔,取出输卵管和卵巢,剔除血管和脂肪,在M2培养液中刺穿输卵管壶腹部,挑出卵丘团,以0.1%透明质酸酶消解卵丘细胞,M2洗涤3遍以上,将卵子分成两份:一份直接进行DIC观察;另一份转移至预平衡的KSOM中培养(CO2、温度条件同1.2.2)。

　　1.2.4  体内受精小鼠桑椹胚和囊胚采集与培养 

　　于第4天10时前选取超数排卵并合笼后有阴道栓的雌鼠,做好标记,继续饲养;第7天10时左右(合笼交配3.5 d)采集体内受精的桑椹胚和囊胚。小鼠断颈处死,打开腹腔,取出子宫和输卵管,用装有M2培养液的1 mL注射器刺穿子宫与输卵管结合部,冲出子宫内的早期胚,M2洗涤3遍以上,转移于预平衡的KSOM中培养(CO2、温度条件同1.2.2)。

　　1.2.5  体外受精和早期胚培养 

　　第4天8~9时在培养皿中做哑铃型M16液滴0.5~1 mL,覆盖石蜡油,体积分数为0.05的CO2平衡≥15 min;将性成熟雄鼠附睾尾(剔除血管与脂肪)剪碎,放入液滴一侧,体积分数为0.05的CO2、37 ℃培养5~10 min;从哑铃型液滴另一侧吸出运动良好的精子悬液适量,调节精子密度为(5~10)×105/mL,置于培养皿中形成50~100 μL小滴,覆盖石蜡油获能培养1~2 h(CO2、温度条件同1.2.2)。

    第4天10时左右,将经超数排卵的雌鼠断颈处死,打开腹腔,取出输卵管和卵巢,剔除血管和脂肪,在M2培养液中刺穿输卵管腹壶部,挑出卵丘团(方法同1.2.3)。吸取卵丘团在M16液滴中清洗两次,加入到精子悬液小滴中,体积分数为0.05的CO2、37 ℃授精培养;于授精培养的不同时间将卵子吸出,观察精卵相互作用情况;拟作早期胚培养者于授精培养5~6 h后,将卵子吸出在M16液滴中洗涤掉多余的卵丘细胞和精子,并将受精卵分成两份:一份直接观察受精结果;另一份移入KSOM液滴中进行早期胚培养(CO2、温度条件同1.2.2)。

　　1.2.6  微分干涉差显微观察 

　　用口吸管将卵子或胚胎移入玻璃培养板上,石蜡油覆盖液滴,置于倒置DIC显微镜下观察。4×物镜寻找目标,20×或40×物镜观察;调节起偏器、检偏器、光圈和聚光器高度至恰当位置,观察图像呈灰色调、图像浮雕感和反差适中为度。采用数码显微摄影系统进行摄影,所有照片均于20×物镜下拍照。

    精子与透明带的相互作用在体外受精实验进行授精培养2 h左右,在倒置显微镜下检查，见卵丘颗粒细胞完全散开,透明带暴露明显时即将卵子吸出,吹吸数次，除去粘附精子，以4%甲醛固定至精子制动后置于DIC显微镜观察;体外受精结果的检查,从移入KSOM时,即授精培养6 h(hCG后23~24 h)起观察单细胞受精卵;排卵前卵母细胞或体内受精的早期胚,从解剖获取细胞/胚胎起观察,此后于连续实验过程的每天上午、下午和晚上各观察1~2次,每次30~90 min,记录观察/拍照时间并分别图像距hCG注射或受精的时程。

　　2  结  果

    DIC显微镜观察卵母细胞和各阶段早期胚,见细胞形态呈浮雕状的立体图像,各种结构边界清晰、细节明显,对比度适当,可以准确生动地显示如细胞与细胞核的边界、细胞质内的细胞器颗粒、细胞核内的核仁、染色质颗粒等微细结构。

    本研究分8个阶段连续观察早期胚形成与发育的全过程,包括:(1)排卵前卵母细胞；(2)排卵后卵母细胞；(3)受精；(4)受精卵；(5)二细胞胚；(6)四细胞胚；(7)八细胞-桑椹胚；(8)囊胚。每个阶段分别观察≥50个目标,选取有代表性的各阶段细胞/胚胎摄影图像并依据时间次序排列，构成图谱。卵母细胞和各阶段胚胎形态的DIC显微图谱见图1。依照从卵母细胞成熟至囊胚扩展的次序,对卵母细胞成熟和早期胚发育全过程的形态特点概要描述如下。

    小鼠卵巢排卵前卵泡中挑取的未成熟卵母细胞,可见卵母细胞肥大,紧贴透明带,细胞质内充满细小的颗粒状物质(简称胞质颗粒);细胞核(生发泡)大而圆,核膜边缘清晰,核内可见核仁及多个染色质颗粒［图1-(1~3)］;部分卵母细胞的生发泡转移靠近细胞表面,胞质颗粒变粗并呈聚集状态,提示细胞骨架发生重组［图1-(3)］。图1-(4~6)为排卵前的成熟卵母细胞,［图1-(4)］示生发泡破裂,胞质颗粒进一步增粗;部分卵母细胞胞质局部呈山丘状突出［图1-(5)］,并排出形成第一极体,胞质颗粒恢复为细小状态［图1-(6)］。排卵后从输卵管壶腹部挑取的卵母细胞与排卵前的成熟卵母细胞在形态上并无显著差别［图1-(7~8)］,细胞质内紧靠极体或附近区域可见纺锤体［图1-(7~8)］,纺锤体处胞质颗粒极少或缺乏。体外受精时,大量精子附着于透明带上,可见卵母细胞因甲醛固定而缩小［图1-(9)］,个别精子穿透透明带［图1-(10~11)］;可见单个精子头部已经穿过卵母细胞膜,并在卵母细胞表层胞质中形成核膨胀［图1-(10~11)］,该处卵母细胞胞质呈锥体状突出成为“受精锥”［图1-(10~11)］;部分卵母细胞在精子核膨胀时即排出第二极体［图1-(11)］。受精后卵母细胞内雌、雄原核形成,早期两原核相距较远,第二极体与第一极体并拢［图1-(12)］;双原核逐渐向受精卵中央迁移［图1-(13)］,并相互靠拢［图1-(14)］,两原核逐渐融合为1个［图1-(14~15)］,核膜清晰,多个核仁清晰可见,细胞体积有所增大,表明原核迁移过程中已经开始进行DNA复制和蛋白质合成,为下一步的卵裂做准备。原核融合后细胞核一分为二［图1-(15~16)］细胞变为多边形并逐渐拉长［图1-(16~17)］,细胞核向两极迁移、细胞中央凹陷,形成“腰”

　　［图1-(18~19)］; 卵“腰”进一步凹陷,细胞一分为二,形成大小相等的2细胞卵裂球［图1-(20~21)］。随后,2细胞卵裂球(也称二细胞胚)内细胞核一分为二,并出现极化分布［如图1-(22~23)。长形的2细胞胚相互旋转并再次卵裂形成4细胞胚［图1-(23~26)］;继而进一步卵裂形成6细胞胚［图1-(27)］、8细胞胚［图1-(28)］、桑椹胚［12~16细胞,图1-(29)］。从8细胞胚开始,细胞之间排列十分紧密,相邻两细胞表面紧贴［图1-(28~29)］。随着胚继续培养,多细胞的桑椹胚内部已难以分辨细胞边界,即所谓致密化［图1-(30~31)］。桑椹胚后期,在胚内部局部出现小的腔隙即胚泡腔,演变为囊胚(亦称胚泡,图1-32);胚泡腔逐渐扩大,部分早期胚细胞形成单层扁平的胚泡壁(滋养层),另一部分细胞位于胚泡腔一侧,形成内细胞团［图1-(33)］;继续培养,内细胞团的细胞数量增多、体积变小,胚泡腔逐步扩大,胚胎体积增大,透明带变薄［图1-(33~34)］,在充分扩展的晚期囊胚,胚泡壁细胞间结合部特别薄［图1-(35)］,此处是做嵌合体动物时ES细胞囊胚注射的最适合位点。

　　3  讨  论

    近年来,对小鼠早期胚进行观察、培养和操作,已经超越了传统的生殖生物学和发育生物学专业而成为生命众多领域中普遍应用的技术。因此,一个早期胚发育全过程系统观察的图谱,对推广、普及这些技术的应用不仅具有重要的实用价值而且具有较强的紧迫性。

　　3.1  DIC显微术的优点 

　　传统对早期胚发育过程形态变化的认识,来源于利用相差显微镜所进行的观察［1］。由于相差显微镜技术存在着图像不够细致、边缘效应即“光晕”显著的固有缺点,使其不能观察细胞内部和边缘的细节,从而难以适应大多数显微操作的需要,故当前对细胞和胚胎进行显微操作时普遍使用更先进的DIC,尤其是在进行基因原核注射、细胞核移植和胞质内精子注射等实验中,DIC成为不可替代的工具［1］。因此,用DIC观察小鼠早期胚发育形态成为胚胎操作实验中的基本功。然而,迄今尚未见利用DIC对小鼠早期胚发育全过程进行系统观察的报道及其相应图谱,不利于胚胎操作技术的推广。DIC是在相差显微镜基础上改进的新一代活细胞观察技术。利用DIC观察细胞与胚胎,细胞形态呈浮雕状的三维图像,细胞内外各种结构边界清晰、细节明显、对比度适当,尤其是其聚焦深度较狭窄,通过调节焦距可以获得细胞不同层面的图像［如图1-(1~2)］,即对细胞进行光学切片，可以准确、生动地显示如细胞与细胞核的边界、细胞质内的细胞器颗粒、细胞核内的核仁、染色质颗粒等微细结构。目前,DIC已全面应用于对活细胞的观察,并可与其他光学显微技术相结合进行细胞/胚胎的生理功能、染色体运动和分子活动的分析［3-5］。因此,利用DIC来观察胚胎发育过程,可以更准确、精确地了解胚胎的发育状态并便于对其进行细致的显微操作。本研究采用DIC显微术,全面系统地观察从卵母细胞成熟至囊胚扩展的早期胚发育全过程,观察时间点密集,观察样本量大,各阶段标本图像的重现率极高,对一些连续变化过程,如原核迁移、卵裂经过等做了连续追踪并对各阶段的形态特征与胚胎发育时相做了较精确的对应。对一些不易观察的微细的细胞内结构,如成熟卵母细胞纺锤体和穿入卵母细胞的精子,本研究也拍摄了明确清晰的图像。因此本研究形成的图谱可借鉴性强，为推广胚胎培养和胚胎操作技术提供了有价值的实验资料和技术依据。

　　3.2  DIC操作要点 

　　运用DIC技术应注意以下操作要点:(1)DIC的光学特性与玻璃载体(如载玻片、玻璃培养皿等)相匹配,而常规使用的塑料细胞/胚胎培养皿,在DIC观察时易产生入射光的折射而出现颜色变化,降低图像的清晰度和立体感,影响摄影效果。故采用塑料培养皿培养细胞/胚胎时一般只适于进行实时检查,要进行精确观察和摄影时,应将标本转移至玻璃载体上观察。同时,在使用恒温载物台时,要避免采用以塑料为材料的恒温板。(2)DIC具有光染色效果,可调出不同彩色图像,但以灰色调图像的立体感和对比度最强。在灰色调下适宜观察细胞内的微细结构及其差别。因此在做精细观察和显微操作时宜采用此色调。(3)DIC具有光学切片效果,对卵母细胞和早期胚这类较大的目标可通过调节显微镜焦距获得不同层面的清晰图像。在对不同目标进行尺寸比较(例如卵母细胞或胚胎直径)时要注意采用同一层面的焦距进行观察,例如在比较不同胚胎的大小时可采用最大直径的层面进行观察。(4)在转换标本或者视野时应注意观察图像效果的变化,必要时可通过细致调节起偏器、检偏器、聚光器光圈达到最佳效果。

【】
  　　［1］Nagy A,Gertsenstein M,Vintersten K,et al. Manipulating the mouse embryo: a laboratatory manual［M］. 3th Ed. New York:Cold Spring Harbor Lab Press, 2003:714,179-185,31-61.

　　［2］黄吴键,袁 进,邓 星,等. KSOM培养基营养成分调整对小鼠植入前期胚体外发育的影响［J］. 第一军医大学学报, 2005,25(3):256-261.

　　［3］Warger W C,Laevsky G S,Townsend D J,et al. Multimodal optical microscope for detecting viability of mouse embryos in vitro［J］. J Biomed Optics, 2007,12(4):44006-44012.

　　［4］Otsuki J,Nagai Y. A phase of chromosome aggregation during meiosis in human oocytes［J］. Reprod Biomed Online, 2007,15(2):191-197.

　　［5］Cody S H,Xiang S D,Layton M J,et al. A simple method allowing DIC imaging in conjunction with confocal microscopy［J］. J Microsc, 2005,217(Pt3):265-274.