大鼠大脑皮质神经元的原代培养

【摘要】  目的 探讨大鼠大脑皮质神经元的培养方法。 方法 体外原代培养新生大鼠大脑皮质神经元,应用免疫细胞化学法及显微镜鉴定神经元。 结果 用神经基础培养基(Neurobasal-A)+B27培养的神经元纯度可达85%,生长状态较佳。 结论 以Neurobasal-A+B27培养的大鼠大脑皮质神经元活性较佳,纯度较高,是体外研究神经系统相关理论的良好模型。

【关键词】  大脑皮质; 神经元; 疾病模型，动物； 细胞，培养的

    ABSTRACT:  Objective  To establish a primary culture method of the rat cortical neurons.  Methods  Primary culture of cortical neurons was made from newborn rats.  Immunocytochemical and electronic micoscopic methods were used to identify the cultured neurons.  Results  The primary cortical neurons cultured with neurobasal-A/B27 grew quite well and the purity was about 85%.  Conclusion  The primary cortical neurons cultured with neurobasal-A/B27 medium are active and rather pure and could be a good model for research of the nervous system.

    KEY WORDS:  cerebral cortex; neurous; disease models,animal; cells,cultured; nuride

    中枢神经系统的各种疾病如缺氧缺血性脑病、中风等对大脑皮质神经元均有不同程度的损伤,为研究其具体的作用机理及防治措施,建立合适的体内外模型至关重要。神经元原代培养是研究神经元形态结构及缺氧、缺血、中毒、外伤等病理因素影响的重要方法之一,为进一步的研究提供良好的原代神经元生物学材料,笔者探讨大鼠大脑皮质神经元的原代培养方法。

　　1  材料与方法

　　1.1  试剂和动物 

　　神经基础培养基(Neurobasal-A)、胎牛血清(FBS)、B27(美国Gibco公司),左旋多聚赖氨酸(PLL,美国Sigma公司),DF-12(美国Hyclone公司),胰蛋白酶(美国Amerisco公司),NSE(Neuron-Specific enolase,神经元特异性烯醇化酶)多克隆抗体(北京中杉金桥生物技术有限公司),UltraVision二抗试剂盒(美国Neomarker公司),其他试剂为国产分析纯。新生健康SD大鼠(<24 h)［福建医科大学实验动物中心,许可证号SCXK(闽)2004-002］。

　　1.2  皮质神经元原代培养
 
　　培养方法按［1-3］改进后进行。大鼠3只,75% 冷乙醇浸泡3~5 min,无菌条件下断头杀死,取出大脑,放入预冷的D-PBS平衡盐液中。在解剖镜下仔细分离去除脑膜及血管,分离出大脑皮质并剪碎成约1 mm×1 mm×1 mm大小。组织块以0.25% 胰蛋白酶消化,并用含10%FBS的DF12完全培养基制成单细胞悬液,以1×106mL-1密度接种在经PLL处理过的培养瓶,于37 ℃、相对体积分数为0.05的CO2培养箱中进行培养。细胞培养4 h后,将种植液(含10% FBS的DF12)全量换成含2%B27的Neurobasal-A培养基维持培养,以后每隔3 d以Neurobasal-A/B27半量换液。培养瓶包被方法:用0.01 mg/mL的PLL 37 ℃包被1 h,PBS洗2遍,直接接种。

　　1.3  形态学观察 

　　将培养不同时间的神经元于LEITZ倒置显微镜下进行观察,注意神经元的生长状况。

　　1.4  免疫细胞化学鉴定 

　　神经元培养4 d,弃去培养液;冷4％多聚甲醛固定20 min;3％H2O2阻断内源性过氧化物酶;封闭后滴加一抗NSE多克隆抗体(1∶200),4 ℃过夜;加二抗(生物素标记羊抗免IgG),室温孵育30 min;DAB显色;中性树胶封固,镜下观察。阴性对照实验用0.01 mol/L PBS代替一抗,其余步骤同上。镜下随机选取30个视野,计数NSE阳性神经元的百分率。

　　1.5  电子显微镜观察 

　　用玻璃瓶常规培养细胞至4 d时,以胰蛋白酶消化分离并收集细胞,迅速投入3 %戊二醛＋1.5 %多聚甲醛混合电镜固定液中,经1 %锇酸后固定,梯度酒精脱水,环氧树脂包埋,超薄切片,透射电镜下观察,注意神经元的超微结构。

　　2  结  果

　　2.1  细胞形态学变化 

　　培养4 h细胞基本贴壁,呈圆形透亮,体积小,立体感强,偶见少数细胞伸出细小短突起。培养1 d,大部分细胞长出突起,长度约为胞体直径的1~2倍,偶见相邻突起相连接;胞体圆形或椭圆形,饱满,光晕明显(图1A)。培养2 d,细胞数目增多,突起增长(图1B)。培养3 d,胞体明显增大,呈圆形、椭圆形或锥体形,表面光滑,折光性强;突起明显增长,较多突起相连接(图1C)。培养4 d后,突起进一步增多、增长。培养6 d时,神经元胞体开始聚集,突起相连呈样生长(图1D)。培养7 d,胞体聚集更明显。随着培养时间的延长,神经元突起纵横交错,难以辨认突起的起源(图1E)。

　　2.2  神经元的免疫组织化学鉴定 

　　取不同培养时间的细胞行NSE免疫组化染色发现:培养4 d以前的细胞含有较多的非神经元细胞,神经元阳性率低;培养5 d以后的细胞神经元阳性率增高,但其胞体开始聚集,甚至突起互相交错、难以辨认突起的起源,染色阳性的神经元形态不典型。取培养4 d的细胞进行染色,发现神经元的形态比较典型,阳性率也较高,其结果显示:NSE阳性神经元的细胞质和突起呈棕色或棕褐色,细胞核淡染,神经元胞体呈圆形、椭圆形或锥体形等,有较长的突起伸出,突起为单极、双极或多极(图2)。阴性细胞的细胞质和突起未呈棕色或棕褐色。NSE阳性细胞百分率,神经元数目可达85%以上。

　　2.3  神经元的超微结构 

　　常规条件下培养4 d的神经元超微结构最典型,在电镜下可见其细胞膜完整,细胞质含有丰富的核糖体、粗面内质网等细胞器;核大,呈圆形或椭圆形,常偏位,核膜完整,染色质分布均匀(图3)。

　　3  讨  论

    神经元体外培养是神经元发育分化、神经再生、神经系统疾病的发生机制等众多研究领域的重要模型,该模型具有影响因素单一、机体复杂因素干扰少和结果易分析等优点。因此神经元体外培养随之成为神经研究领域的关键技术。在神经元的体外培养过程中应注意以下几个方面。

　　3.1  培养液的选取 

　　培养液是否合适是神经元培养能否成功的关键因素之一。血清中含有多种蛋白质、多肽、激素、生长因子等营养物质能够促进神经元贴壁生长及对体外环境的适应,但血清对胶质细胞的增殖作用很强。在神经组织的分离细胞悬液中,除了神经元之外,还有一些非神经元细胞是无法完全去除的,包括神经胶质细胞、脑脊膜细胞以及成纤维细胞等［4］。因此所采用的培养液应尽量减低非神经元细胞的存活力,提高神经元的纯度。

    以往神经元的培养多采用DMEM培养基,并以抗有丝分裂剂阿糖胞苷来抑制神经胶质细胞的生长［3,5］,获得较高的纯度。但阿糖胞苷对神经元亦有一定的毒性,对其活性有不同程度的影响,并且大量胶质细胞死亡后的产物也不利于神经元的生长。故本实验选用富含神经元生长所需的各种营养物质的神经基础培养基,它被认为是神经元培养的良好基质［6］。本实验对神经元原代培养方法的改进之处在于:不用阿糖胞苷等有丝分裂抑制剂,培养中不是全程使用有血清培养基,而是以有血清培养基(含10%胎牛血清的DF12培养基)作为种植液,种植培养4 h后,全量换为无血清限定性培养基(Neurobasal＋B27)维持培养。由于培养中不加入阿糖胞苷,避免了其毒性作用。其中种植液中所含的血清能够保证细胞基本贴壁,提高了培养细胞的存活率;而维持液中的Neurobasal-A+B27添加物不仅能够促进原代培养神经元的存活和生长分化,还能抑制非神经元的分裂增殖［1］,因此大大提高了神经元的纯度。实验结果发现采用此法培养神经元时,神经元的生长更接近体内环境,细胞状态良好,神经元突起间形成样的生长趋势,神经元培养4 d时的阳性率可达85%左右;电镜结果亦表明所培养的神经元超微结构完整、细胞器丰富。故笔者以为,此法不需使用抑制胶质细胞的药物,减少药物对神经细胞的损伤,培养的神经元活性较佳,可以推广应用。

    报道用Neurobasal＋B27培养的神经元纯度高达90%甚至99%［1,7-8］,但本实验培养的神经元纯度仅为85%,相差甚远,可能是取材部位不同,或者取材不够准确、非神经细胞过多、神经元活性差,抑或细胞培养时间不同等因素的影响。笔者认为培养的神经元中含有少量的杂质细胞如胶质细胞等,使二者处于共存状态,更接近体内环境,更有利于神经元的生长;培养神经元纯度达85%已基本能满足体外研究的需要。

　　3.2  促贴壁物质的使用 

　　用于培养神经元的瓶、皿及盖玻片宜用多聚赖氨酸、层粘连蛋白或鼠尾胶原预先包被。未用PLL等包被时神经细胞易聚集成团、基本不贴壁或仅有少数几个贴壁,无法继续培养。用PLL包被时,其浓度从0.01 mg/mL到0.25 mg/mL均可,本实验室曾用过0.01,0.025,0.1 mg/mL未发现有明显区别。但大剂量PLL对细胞有毒性,有时神经元生长缓慢可能与此有关,故在保证贴附的前提下,浓度越低越好。

　　3.3  细胞接种密度的选择 

　　体外培养的神经元在缺乏外源性神经营养因子的情况下,存活率与接种的细胞密度尤为相关,接种密度过小时,神经元很难存活;而细胞密度过高时又可产生接触抑制,神经元的存活率也很低,且密度高时神经元间突起互相交错而不便于观察单个神经元体外发育过程中树突、轴突、生长锥、突触等亚细胞结构的变化。因此,选择合适的接种密度尤为重要。本实验经过较长时间的摸索发现,大鼠大脑皮质神经元以1.0×105cm-2 (1.0×106mL-1)的密度接种时生长状态较佳,笔者认为细胞培养至4 d时形态最典型可能与此接种密度有关。因此,不同实验室采用不同密度接种时,细胞出现典型形态的时间不一致,对细胞进行干预的时间随之而异。

　　3.4  杂质的去除 

　　研究发现刚接种培养的神经元前2~3 d背景较脏,可见较多杂质,但并不影响神经元的生长,经换液后背景逐渐变清晰。神经元长到3~4 d时,杂质变少，取材干净及低速离心可减少杂质。此外,还应注意鼠龄、取材、消化、换液等问题。

【文献】
  　　［1］Brewer G J.Serum-free B27/neurobasal medium supports differentiated growth of neurons from the striatum,substantia nigra,septum,cerebral cortex,cerebellum,and dentate gyrus［J］. J Neurosci Res, 1995,42(5):674-683.

　　［2］Tong L,Balazs R,Thornton PL,et al. Beta-amyloid peptide at sublethal concentrations downregulates brain-derived neurotrophic factor functions in cultured cortical neurons［J］. J Neurosci, 2004,24(30):6799-6809.

　　［3］罗湘颖,杨志敏,王廷华,等. 胎鼠大脑皮质神经元的体外培养及鉴定［J］. 神经解剖学杂志, 2004,20(5):505-508.

　　［4］Graham J M.Isolation of rat and human hippocampal neuron fractions in a discontinuous density gradient［J］. Sci World J, 2002,2:1634-1637.

　　［5］黄卫东,费 舟,章 翔,等. 体外培养大鼠脑皮层神经元机械性损伤模型的建立［J］. 第四军医大学学报, 2004,25(4):307-309.

　　［6］Bradley J,Sporns O.BDNF-dependent enhancement of exocytosis in cultured cortical neurons requires translation but not transcription［J］. Brain Res, 1999,815(1):140-149.

　　［7］Velasco I,Velasco-Velazquez M A,Salazar P,et al. Influence of serum-free medium on the expression of glutamate transporters and the susceptibility to glutamate toxicity in cultured cortical neurons［J］.J Neurosci Res, 2003,71(6):811-818.

　　［8］Soto E,Limon A,Ortega A,et al. Morphologic and electrophysiologic characteristics of cultured vestibular ganglia neurons［J］. Gac Med Mex, 2002,138(1):1-13.