水溶性CdSe/CdS核壳纳米晶与牛血清白蛋白的相互作用

                 作者：林成芳， 黄风华， 蓝亚玲， 程陈， 王锐环 

【摘要】  目的探讨以半胱氨酸（Cys）表面修饰的CdSe/CdS核壳纳米晶（CdSe/CdS/Cys）在标记牛血清白蛋白中的应用。方法用紫外及荧光光谱法研究CdSe/CdS/Cys纳米晶与牛血清白蛋白的相互作用。结果标记牛血清白蛋白后CdSe/CdS/Cys纳米晶的荧光发射峰强度明显增强。结论新型CdSe/CdS/Cys纳米晶可用于标记牛血清白蛋白，标记牛血清白蛋白的CdSe/CdS/Cys的吸收及发射光谱变化可能是由于二者之间存在配位以及静电相互作用。

【关键词】  纳米结构； 生物学标记； 牛血清白蛋白； 光谱分析

  由于半导体纳米晶具有量子尺寸效应和表面效应，因而展现出独特的物理和化学特性，具有优良的光谱特征和光化学稳定性，其作为荧光生物探针，在生物医学方面的潜在应用价值引起工作者的极大关注[1?5]。1998年，Alivisators等首次报道了将半导体纳米晶作为荧光探针对鼠组织细胞进行标记[1]，纳米晶在生物科学中的应用很快就引起人们的兴趣。但由于早期的纳米晶是在有机相中制得，因此不溶于水、不适于生物应用，这种方法制得的纳米晶需通过改性转移到水相中，而改性往往使得纳米晶发光量子产率降低[4]。在水相中直接合成具有高荧光量子产率、发光稳定的水溶性核壳式纳米晶是目前研究的热点[6?8]。唐爱伟等已合成了巯基乙酸为稳定剂的CdSe/CdS核壳纳米晶[6]，因巯基乙酸具有毒性，故本课题组以无毒性的半胱氨酸（Cys）为表面修饰剂及稳定剂，在水相中合成了CdSe/CdS/Cys核壳纳米晶（合成表征部分另文发表），该纳米晶具有高的发光量子产率和光化学稳定性，并且表面修饰剂含有?COOH及?NH2两种基团，故CdSe/CdS/Cys核壳纳米晶具良好的水溶性及生物相容性。在前期工作的基础上，笔者用紫外及荧光光谱研究该新型水溶性CdSe/CdS/Cys核壳纳米晶与牛血清白蛋白的相互作用，为其在生物医学研究方面的进一步应用奠定基础。

    1材料与方法

    1.1仪器Cary 50紫外可见吸收光谱仪（美国瓦里安公司）；RF?540型荧光分光光度计（日本岛津公司）；PHS?3C精密pH计（上海雷磁仪器厂）。

    1.2试剂3?（羟甲基）氨基甲烷（简称Tris碱，BR级，上海国药集团）、牛血清白蛋白（BSA，相对分子质量67 000，BR级，上海伯奥生物科技有限公司），水溶性CdSe/CdS/Cys核壳纳米晶由本实验室合成并提纯，实验用水为二次蒸馏水。

    1.3水溶性CdSe/CdS/Cys纳米晶与牛血清白蛋白作用准确称取BSA 670 mg溶解于二次水，并定容至100 mL，放置于4 ℃冰箱保存，作为储备液。往10 mL容量瓶中加入一定量的纳米晶溶胶及一定体积的1×10?4 mol/LBSA溶液，用Tris?HCl缓冲液（pH 7.4）稀释至10 mL，静置1 h，扫描荧光光谱（λex＝420 nm）及紫外吸收光谱。

    2结果

    2.1水溶性CdSe/CdS/Cys纳米溶液及牛血清白蛋白的荧光光谱水溶性CdSe/CdS/Cys纳米溶液的激发和发射光谱见图1A，该纳米粒子发射峰位于567 nm，是一强的荧光发射峰（λex＝420 nm）。牛血清白蛋白的发射峰位于345 nm与666 nm处（图1B，λex＝275 nm）。牛血清白蛋白的荧光与水溶性CdSe/CdS/Cys纳米晶的在测定过程中互不干扰。

    2.2CdSe/CdS/Cys核壳纳米晶与牛血清白蛋白作用的光谱分析

    2.2.1CdSe/CdS/Cys核壳纳米晶与牛血清白蛋白作用的紫外吸收分析CdSe/CdS/Cys核壳纳米晶浓度一定，不断增加BSA的浓度所得吸收光谱见图2。随着BSA的浓度从0增加到4×10?5 mol/L，纳米晶的吸光度逐渐减弱，在457 nm处出现一等吸收点。

    2.2.2CdSe/CdS/Cys核壳纳米晶与牛血清白蛋白作用的荧光分析25 ℃下CdSe/CdS/ Cys核壳纳米晶与CdSe/CdS/Cys?BSA在不同pH的TrisHCl缓冲液体系中的荧光图谱见图3。a,b，c,d, e曲线为CdSe/CdS/Cys核壳纳米晶在pH为5，6，7.4，8，9下的荧光曲线，而f,g,h,i,j分别为CdSe/CdS/Cys?BSA在pH为5，6，7.4，8，9下的荧光曲线。用公式

    ΔF＝FCdSe/CdS/Cys-BSA?FCdSe/CdS/Cys

    （式中F为荧光强度值）

    求出各pH下的两种溶液体系的荧光强度差值ΔF，再用ΔF对pH作图，可得图4。由图4可以看出，随着pH的增大，ΔF逐渐增大，当pH为7.4时，ΔF最大，也即敏化程度最大，继续增大pH，则ΔF则减小。可见pH＝7.4时，BSA对该纳米晶的敏化程度最大。

    对CdSe/CdS/Cys核壳纳米晶与不同物质的量的牛血清白蛋白相互作用情况进行荧光光谱研究发现，以420 nm激发，该核壳纳米晶的荧光发射峰位于569 nm处，在纳米晶浓度不变的条件下，往纳米晶溶液中加入牛血清白蛋白，发射峰强度明显增强，峰的位置略有红移（图5）。

    2.2.3猝灭常数的测定对牛血清白蛋白与不同物质的量的CdSe/CdS/Cys核壳纳米晶相互作用情况进行荧光光谱研究（pH＝7.4）发现，以275 nm激发，当BSA浓度一定时，往BSA溶液中加入不同浓度的CdSe/CdS/Cys核壳纳米晶，随着CdSe/CdS/Cys核壳纳米晶浓度逐渐增大，牛血清白蛋白的荧光强度急剧下降，CdSe/CdS/Cys核壳纳米晶浓度为5.0×10-4 mol/L时，牛血清白蛋白荧光几乎被完全猝灭，纳米晶猝灭了牛血清白蛋白的荧光（图6）。一般地，猝灭剂对荧光体的猝灭作用可用Stern?Volmer方程式描述为：

    F0/F =1+Kqτ0[Q]＝1+Ksv[Q]

    其中F0、F分别为未加猝灭剂时和加入猝灭剂时的荧光强度。Kq为双分子猝灭过程的速率常数，τ0为没有猝灭剂存在下荧光分子的平均寿命。Q代表的是猝灭剂，[Q]代表猝灭剂的浓度，Ksv称为Stern?Volmer猝灭常数，它可以大致反应出猝灭剂和荧光体之间相互作用的情况。当猝灭剂浓度低时服从Stern?Volmer方程式，由荧光强度F0/F对猝灭剂作图可以得到斜率Ksv即Stern?Volmer猝灭常数。

    CdSe/CdS/Cys核壳纳米晶浓度 a:0; b:0.25; c:0.5; d:0.75; e:1.0; f:1.25; g:1.5; h:2.0; i:2.5; j:5.0(×10-4 mol/L). λex＝275 nm.

    图625 ℃，不同浓度BSA的CdSe/CdS/Cys核壳纳米晶溶液中的荧光图谱

    Fig 6Fluorescence spectra of BSA at various concentrations of CdSe/CdS/Cys nanocrystals

    25 ℃与37 ℃，pH 7.4，从CdSe/CdS/Cys核壳纳米晶对牛血清白蛋白荧光猝灭的数据作Stern?Volmer曲线（图7），将图7的结果整理得表1。

    3讨论

    3.1CdSe/CdS/Cys核壳纳米晶与牛血清白蛋白作用的紫外吸收光谱分析该纳米晶的吸光度逐渐减弱，这是由于BSA的浓度的增加，产生减色效应的缘故[10]；同时等吸收点的出现，则说明有新物质的生成，减色效应及等吸收点的出现这两种现象均表明了CdSe/CdS/Cys核壳纳米晶与BSA之间可能存在较强的相互作用。

    3.2CdSe/CdS/Cys核壳纳米晶与牛血清白蛋白作用的荧光光谱分析当pH为6～8时，BSA的加入使得体系的荧光强度相对于原CdSe/CdS/Cys纳米晶明显增强，原因可能是：（1）在该pH下，CdSe/CdS/Cys表面的半胱氨酸以羧基的形式存在，使纳米晶表面带负电荷，与BSA中带正电荷的氨基酸残基有静电作用[11]；（2）BSA的氨基酸侧链中的羧基与CdSe/CdS/Cys纳米晶的Cd（Ⅱ）进行二次配位[12]。

    同时，CdSe/CdS/Cys纳米晶的荧光强度随BSA浓度的增加而增强，可能是由于加入BSA之后，BSA以某种方式与纳米晶相互作用（静电或配位作用）而包覆在核壳纳米晶表面，起到钝化纳米晶表面和量子限域作用，使得荧光发射峰红移，荧光明显增强[5]。

    3.3CdSe/CdS/Cys纳米晶对牛血清白蛋白荧光猝灭常数的测定25 ℃，37 ℃下纳米晶对蛋白的猝灭常数分别为1.656 5×104，1.120 6×104 L/mol，故可说明Cys修饰的核壳CdSe/CdS/Cys纳米晶体对牛血清白蛋白具有较强的猝灭作用，而温度升高，Ksv反而更小，也即斜率减小，表明该猝灭为静态猝灭过程[13]，从而也说明了纳米晶与BSA之间存在相互作用，生成了复合物[14]。

    通过以上几个方面的分析，可知牛血清白蛋白与CdSe/CdS/Cys核壳纳米晶之间可能存在静电或配位作用，形成复合物，表明新型CdSe/CdS/Cys纳米晶可用于标记牛血清白蛋白，进一步的实验还将研究如何将标记了CdSe/CdS/Cys纳米晶后的荧光生物探针应用到生物大分子检测中去，进一步的研究可望使该新型半导体纳米晶生物荧光探针在生物医学上有广阔的应用。

【】
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