PPARγ2基因Pro12Ala多态性与肥胖的相关性

【摘要】  目的 探讨PPARγ2基因Pro12ALa多态性与肥胖相关性。方法将研究对象按体质量指数（BMI）分为肥胖组（n=62）和非肥胖组（n=121）。再将所有对象分为糖尿病组（DM组,n=79）、对照组（NC组,n=104）；DM组和NC组再分别根据BMI分为肥胖组与非肥胖组。应用聚合酶链反应?限制性内切酶片段长度多态性方法检测PPARγ2基因Pro12Ala多态性。比较肥胖与非肥胖组、DM组中的肥胖与非肥胖人群、NC组中的肥胖与非肥胖人群基因型频率及等位基因频率。结果肥胖组和非肥胖组基因型频率和等位基因频率无显著性差异（P>0.05）。进一步分组， DM组中肥胖组和非肥胖组基因型频率、等位基因频率之间无显著性差异（P>0.05），NC组中肥胖组和非肥胖组基因型频率无显著性差异（P>0.05），而等位基因频率有显著性差异（P<0.05）。结论PPARγ2基因Pro12Ala多态性与无T2DM家族史的正常人群肥胖有关，与糖尿病组中肥胖人群无关。

【关键词】  过氧化物酶体增殖物激活受 糖尿病 型 肥胖症 多态性 限制性片断长度 聚合酶链反应

    肥胖和糖尿病有密切关系。调查发现，70%～80%的2型糖尿病(T2DM)患者同时是肥胖者，它们可能有共同的遗传因素。过氧化物酶体增殖物激活受体(peroxisome proliferator?activated receptor,PPAR) ?γ是由配体激活的核转录因子，属Ⅱ型核受体超家族成员，PPARγ2与脂肪细胞分化、肥胖、胰岛素抵抗关系密切而成为近年来研究的热点。PPARγ2基因外显子B的第12密码子的脯氨酸替换为丙氨酸，即Pro12Ala是PPARγ2最常见的多态位点。目前有关PPARγ2基因Pro12Ala多态性肥胖相关性国内外研究不一致[1?3]。笔者应用聚合酶链反应?限制性内切酶片段长度多态性（PCR?RFLP）方法，对西安地区肥胖与非肥胖组、糖尿病组中的肥胖与非肥胖人群、对照组中的肥胖与非肥胖人群PPARγ2基因Pro12Ala多态性研究，探讨PPARγ2基因Pro12Ala多态性与肥胖的相关性。

    1对象与方法

    1.1对象来源于2001年我院门诊、住院病人及健康查体者。首先将研究对象按体质量指数（BMI）分2组：（1）肥胖组（BMI≥25 kg/m2，n=62）。男性41例，女性21例，年龄（52.84±8.23）岁（43～74岁）。（2）非肥胖组（BMI<25 kg/m2，n=121）。男性70例，女性51例，年龄（53.47±7.54）岁（45～73岁）。再将研究对象按[4]标准分为2组：（1）糖尿病组（DM组，n=79），均为T2DM患者，且其家族中有血缘关系的T2DM患者≥2人，男性44例，女性3例，年龄（54.41±7.30）岁（46～74岁）；（2）对照组（NC组，n=104），均与T2DM无血缘关系，经口服糖耐量（OGTT）试验排除T2DM且符合糖耐量正常的诊断标准，男性67例，女性37例，年龄（53.90±8.41）岁（43～72岁）。然后再按BMI将DM 组分为肥胖组（n=29）与非肥胖组（n=50）；将NC组分为肥胖组（n=33）与非肥胖组（n=71）。

    研究对象由医护人员在标准条件下按统一规范测量身高、体质量，并BMI。

    1.2方法

    1.2.1主要试剂全基因组DNA小量制备试剂盒（天为时代有限公司）；PCR引物和内切酶HpaⅡ（北京赛百盛基因技术有限公司）。

    1.2.2基因组 DNA的提取每位对象空腹12～14 h后抽取静脉血1 mL，EDTA抗凝，按全基因组DNA小量制备试剂盒提取DNA，-20 ℃保存。

    1.2.3PPAR基因PCR扩增

    引物序列[5]：

    上游：5′?GCC AAT TCA AGC CCA GTC?3′

    下游：5′?GAT ATG TTT GCA GAC AGT GTA TCA GTG AAG GAA TCG CTT TCC G?3′

    PCR反应体系总体积13 μL。包括Mix 6 μL，上游引物2 μL，下游引物2 μL，蒸馏水2 μL，模板DNA 1 μL。反应条件：94 ℃ 5 min→94 ℃ 45 s→56 ℃ 45 s→72 ℃ 30 s，共30个循环，最后72 ℃延伸7 min。

    1.2.4PPARγ2Pro/Ala基因型鉴定PCR产物用

    HpaⅡ酶切。酶切体系为：总体积20 μL，包括10 μL PCR产物、0.5 μL HpaⅡ（5单位内切酶）、7.5 μL DDW、2 μl 10×缓冲液，37 ℃水浴箱中，消化约4 h；酶切产物用30 mg/L琼脂糖凝胶电泳（80 V，1 h）、265 nm的紫外灯下观察结果。Pro 12纯合子（PP）电泳带型为224 bp、43 bp， Ala12纯合子（AA）电泳带型267 bp，Pro/Ala杂合子（PA）电泳带型267 bp、224 bp、43 bp,以此计算基因型频率及等位基因频率。比较各组基因型频率及等位基因频率。

    1.3统计学处理使用SPSS10.0统计软件包。

    基因型频率及等位基因频率分布比较使用χ2检验，以P＜0.05为差异显著性阈值。

    2结果

    2.1肥胖与非肥胖组基因型频率、等位基因频率比较无统计学意义（P>0.05，表1）。

    2.2DM组中肥胖组和非肥胖组基因型频率、等位基因频率比较无统计学意义（P>0.05）。NC组中肥胖组和非肥胖组基因型频率比较无统计学意义（P>0.05），但等位基因频率比较有统计学意义（P<0.05，见表2）。表 1肥胖组与非肥胖组PPARγ2基因Pro12Ala多态性比较表 2对照组及糖尿病组PPARγ2基因Pro12Ala多态性比较表中数据为例数（%）.PP: Pro12纯合子;PA: Pro12/Ala12杂合子;AA:Ala12纯合子.

    3讨论

    肥胖是糖尿病、高血压及冠心病等常见代谢病的主要因素，对肥胖发病的遗传及环境因素的研究日益受到重视。PPARγ2的基因存在多态性表现，其氨基酸端含有一个不依赖于配体而依赖于胰岛素的活化区域，脯氨酸转变为丙氨酸即Pro12Ala位于该区域内，脯氨酸有防止α螺旋形成的作用，而丙氨酸有促进α螺旋形成的作用，该氨基酸的改变将造成PPARγ2结构的改变，从而影响其活性[6]。

    本研究结果，肥胖组中基因型频率、等位基因频率较非肥胖组高，但两者统计学分析无显著性差异。说明Pro12Ala基因的多态性与西安地区肥胖无关。进一步分组分析，在DM组中PA基因型频率、A等位基因频率在肥胖组中高于非肥胖组者，但无统计学意义；在NC组中PA基因型频率在肥胖组中高于非肥胖组，亦无统计学意义，而A等位基因频率在肥胖组中显著高于非肥胖组，说明Pro12Ala变异可能与NC组人群肥胖有关，而与T2DM患者的肥胖无相关性，这与一些国内外研究一致[7?11]。

    目前，Pro12Ala基因的多态性的A等位基因增加肥胖易感性的确切机理尚未清楚，携带A基因的人群由于PPARγ2转录活性下降，解偶联蛋白2（UCP2）表达不足，机体能量消耗减少，导致PPARγ2主要表达部位，即腹部皮下脂肪组织蓄积引起肥胖。Pro12Ala基因的多态性与正常对照人群的肥胖有关，而与糖尿病组的肥胖人群无关可能还有其他机制。研究显示，A等位基因具有一定的改善胰岛素抵抗的功能，可增加胰岛素的敏感性[12]。体质量增加可能与胰岛素敏感性增加，特别是脂质降解减少有关，后者引起生理胰岛素分泌（如餐后）过程中储存于甘油三酯内的游离脂肪酸水平的过度增加[13]。在这种假设下，肥胖可能是由于胰岛素敏感性增加而不是A等位基因直接作用的结果。在对照组中没有多种T2DM易感基因作用引起的胰岛素抵抗和胰岛素分泌的轻度减退，Pro12Ala多态性可以增加胰岛素的敏感性和减少T2DM的发生，但较T2DM组易于发生肥胖。而糖尿病组中A等位基因具有的改善胰岛素抵抗的功能可能被抵消，因而与肥胖无关。由此可以推出在携带A基因的糖尿病人群由于PPARγ2转录活性下降，使用噻唑烷二酮类增敏剂可能会更加有效,且不必担心胰岛素增敏剂所引起的肥胖。当然肥胖也是一种发生于多基因、多因素基础上的常见代谢失调症，今后在此方面还需扩大样本量进一步分析研究。

    笔者认为，PPARγ2基因Pro12Ala多态性与西安地区汉族无T2DM家族史的正常人群肥胖有关，而与T2DM肥胖人群不相关。

【】
  /[1/]Kadowaki T. PPAR gamma agonist and antagonist/[J/]. Nippon Yakuri Zasshi, 2001(1),118:321?326.

/[2/]Hasstedt S J,Ren Q F,Teng k,et al. Effect of the peroxisome proliferator activated receptor gamma2 Pro12Ala variant on obesity,glucose homeostasis,and blood pressure in member of familial type 2 diabetic kindreds/[J/]. J Clin Endocrinol Metab, 2001,86(2):536?541.

/[3/]Kawasaki I,Tahara H,Encoto M,et al. Impact of Pro12Ala variant in the peroxisome proliferator activated receptor(PPAR) gamma 2 on abesity and insulin resistance in Japanese type, 2diabetic and healthy subjects/[J/]. Osaks City Med J, 2002,48(1):23?28.

/[4/]钱荣立. 关于糖尿病的新诊断标准与分型/[J/]. 糖尿病杂志, 2000,8(1): 4?5.

/[5/]Yen C J,Beamer BA,Negri C,et al. Molecular scanning of the human peroxisome proliferator activated receptorγ (hPPAR)gene in deabetic cancasians: identification of a Pro12Ala PPARγ2 missense mutation/[J/]. Biochem Biophys Res Commun, 1997,241(2):270?274.

/[6/]Muller A P,Miserez A R.Identification of mutations in the gene encoding sterol regulatory element?binding protein(SREBP)?2 in hypereholesterolaemic subjects/[J/]. J Med Genet, 2002,9(4):271?275.

/[7/]项坤三,陆惠娟,贾伟平,等. 过氧化物酶增殖体激活受体?γ2基因Pro12Ala变异对常见代谢病的影响/[J/]. 中华内分泌代谢杂志, 2000,16(3):164?168.

/[8/]傅茂,程桦,李秀均,等. 过氧化物酶增殖体激活受体?γ2基因Pro12Ala变异与2型糖尿病的关系/[J/]. 中华医学遗传学杂志, 2002,19(3):234?238.

/[9/]董艳，李果,骆天红，等. PPARγ2基因Pro12Ala变异与上海地区2型糖尿病的相关性/[J/]. 上海第二医科大学学报, 2004,24(5):345?347.

/[10/]傅健,池上博司,吕远栋,等. 过氧化物酶体增殖物激活受体γ2基因Pro→Ala可能是我国汉族人2型糖尿病的保护性等位基因/[J/]. 中华糖尿病杂志, 2005,13(5):363?365.

/[11/]Cole S A,Mitchell B D,Hsueh W C,et al. The Pro12Ala variant of peroxisome proliferator activated receptor?gamma2(PPAR?gamma2)isassociated with measure of obesity in Mexican Amcricans/[J/]. Int J Obesity Relat Meteb Disord, 2000,24(4):522?524.

/[2/]Li W D, Lee J H, Price R A. The peroxisome proliferator activated receptor?gamma2 Pro12Ala mutation is associated with early onset extreme obesity and reduced fasting glucose/[J/]. Mol Genet Metab, 2000,70(2):159?161.

/[13/]Stumvoll M, Haring H. Reduced Lipolysis as possible calls for greater weight gain in subjects with the Pro12Ala polymorphism in PPARγ2/[J/]. Diabetologia, 2002,45(1):152?153.