白细胞介素?8基因?251A/T多态性与急性胰腺炎的关系

【摘要】  目的探讨白细胞介素?8(IL?8)启动子区域?251基因多态性及血浆IL?8水平与急性胰腺炎合并全身炎症反应综合征(SIRS)的关系。方法应用聚合酶链反应?限制性片段长度多态性分析方法(PCR?RFLP)测定71例急性胰腺炎(AP)患者/[轻型(MAP)36例,重型(SAP)35例/]IL?8?251A/T的基因多态性,酶联免疫吸附法检测血浆IL?8水平。结果IL?8?251A/A+A/T基因型出现的频率在SAP组和MAP组存在差异,AP组和对照组差别无统计学意义;AA基因型AP组和对照组差别有统计学意义;各基因型出现频率在AP是否合并SIRS组差别无统计学意义。各组血浆IL?8水平差别有统计学意义。IL?8?251基因多态性与血浆IL?8水平有相关性。结论IL?8?251基因多态性可能是AP病情进展的危险因素;IL?8?251基因多态性可影响血浆IL?8水平,血浆IL?8水平与AP病情程度有关。

【关键词】  白细胞介素8 基因 多态性 制性片段长度 急性病 胰腺炎

    急性胰腺炎(AP)尤其是重症急性胰腺炎(SAP)在发生过程中常合并全身炎性反应综合征(SIRS)及多器官功能障碍综合征(MODS),并导致死亡。一般认为促炎细胞因子在发病过程中发挥重要作用,白细胞介素?8(IL?8)在AP时表达明显增加,有合并SIRS的尤为明显[1],与疾病严重程度相关。笔者探讨IL?8?251A/T基因多态性及IL?8水平与AP的关系。

    1对象与方法

    1.1对象选择2005年8月~2007年1月的住院患者71例,男性33例,女性38例,年龄(46.3±14.3)岁(20~75岁)。其中轻型(MAP)36例,SAP 35例;合并SIRS组34例,无SIRS组37例。在SAP组中,Ⅰ型15例,Ⅱ型10例。AP诊断标准参照[2];SAP诊断依据APACHE Ⅱ评分≥8分,Balthazar CT评分≥4分[3];SIRS诊断依据文献[4]。为使入选者在基因学上具有一致性和可比性,所有研究对象都是汉族,且排除以下情况:(1)年龄>75岁;(2)白细胞<0.4×109 L-1;(3)正在应用免疫抑制剂;(4)慢性胰腺炎。随机选择70例健康体检者作为对照组,男性39例,女性31例,年龄(48.9±15.1)岁(28~85岁)。各组间性别及年龄比较差别无统计学意义。

    1.2方法

    1.2.1测定血浆IL?8取外周血后,EDTA抗凝,离心,置于-70 ℃冰箱(Fax2100,美国Stat公司)保存以待统一测定。应用酶联试剂盒(深圳晶美生物制品公司)、酶标仪(EL?311S型,美国BIO?TEK公司)测定IL?8。

    1.2.2提取基因组DNA取外周静脉EDTA抗凝血3 mL,红细胞裂解液收集白细胞,酚/氯仿法提取基因组DNA,用适量的三羟甲基氨基甲烷盐酸盐与乙二胺四乙酸二钠的配制液(TE)或双蒸水溶解,置于-70 ℃冰箱保存。

    1.2.3基检测因多态性应用聚合酶链反应?限制性片段长度多态性(PCR?RFLP)技术检测,先用PCR技术扩增IL?8启动子上游108 bp片段,引物设计参照文献[5]:

    上游P1: 5’TTCTAACACCTGCCACTCTAG3’

    下游P2: 5’CTGAAGCTCCACAATTTGGTG3’

    引物由上海生工生物工程有限公司合成。反应在PCR仪(PTC?200,美国MJ Research公司)上进行,反应体系25 μL,TaqDNA聚合酶2 U,dNTP 200 μmoL/L,引物P1,P2浓度20 pmoL/L,模板DNA 50~100 ng,反应条件为94 ℃预变性4 min→94 ℃ 30 s→60 ℃ 30 s→72 ℃ 30 s,循环35次,72 ℃延伸7 min(美国TaKaRa公司)。PCR产物经2%琼脂糖电泳,溴化已啶染色,紫外透射仪观察,扩增成功DNA片段(108 bp)。PCR产物取10 μL,加10×buffer 2 μL,加限制性内切酶Mfe1 5 U(英国BioLabs公司),在37 ℃水浴消化2~16 h,用3%琼脂糖电泳,溴化已啶染色,紫外透射仪观察分析酶切产物,IL?8基因?251位点有3种基因型,如为TT纯合子,则1条DNA片段长度为108 bp,AT杂合子3条DNA片段长度分别为108,76,32

    bp,AA纯合子2条DNA片段长度为76和32 bp。

    1.3统计学处理采用SPSS 10.0统计软件,计数资料如基因多态性比较用χ2检验,计量资料如血浆IL?8水平用t检验,血浆IL?8水平用x±s表示。P<0.05为有统计学意义。

    2结果

    2.1基因多态性检测对象IL?8?251位点为AA、AT、TT 3种基因型(图1),这种多态性的等位基因频率经检验处于Hardy?Weinberg平衡状态。

    2.2基因型出现频率IL?8?251A/A+A/T基因型SAP组为24(68.6%),MAP组为16(44.4%)(χ2＝4.2,P<0.05)。IL?8?251A/A基因型在AP组和对照组差别有统计学意义,AA纯合子基因型在AP组为8(11.3%),对照组为2(2.8%)(χ2=2.3,P<0.05)。AP患者合并SIRS组各基因型与无合并SIRS组差别无统计学意义(P>0.05)。在SAP合并Ⅰ型与合并Ⅱ型各基因型比较差别无统计学意义(P>0.05,表1)。

    1,2,5,8:T/T未突变基因型; 3,4,6:A/T杂合子基因型; 7:A/A纯合子基因型.

    图1IL?8?251A/T基因多态性3%琼脂糖凝胶电泳结果

    Fig 1Interleukin?8 gene?251A/T polymorphism in the result of the 3%sepharose electrophoresis

    2.3基因多态性与血浆IL?8水平的关系AP患者按照不同基因型分为AA、AT、TT基因型组,AT+AA组血浆IL?8的水平与TT组比较,差别有统计学意义[(111.97±20.11)vs(90.29±12.94),P<0.05,表1]。表1IL?8?251A/T基因多态性在各组间的分布特点除白细胞介素?8（IL?8）外，表中数据为例数（%）.△与对照组比较,#:P<0.05; 与轻型组比较,☆:P<0.05; 与SIRS比较,△:P<0.01.

    3讨论

    IL?8是一种能激活嗜中性粒细胞的趋化性细胞因子对炎症和免疫应答过程有重要的调节作用[6]。本研究发现：(1)AP组和对照组比较,AA基因型出现频率的差别具有统计学意义(P<0.05),说明在遗传背景下携带AA基因型者发生AP的风险可能增加。但AP的发生是多因素的AA基因型对AP的发生的影响大小还需要增加其他位点及病例数研究。(2)比较SAP组与MAP组,发现携带A基因位点者前者明显高于后者(P<0.05),同时AA+AT基因型患者血浆中IL?8的水平高于TT基因型患者(P<0.05),说明在AP中携带A基因位点使IL?8量高表达,加重了全身炎性反应,成为AP病情加重的一个危险因素。由于SAP发病存在个体差异性,如果它在SAP中的影响能进一步确立它可作为个体差异性的一个指标给予提前干预措施。(3)比较SIRS组与非SIRS组.以及SAP合并Ⅰ型与合并Ⅱ型,各基因型均无统计学意义(P>0.05),说明IL?8?251的基因多态性与AP患者合并SIRS及脏器功能损伤并无相关性。

    本研究亦证实，IL?8水平的高低与AP的病情严重程度及并发症的发生率呈正相关,与国内外报道一致[7],可以作为AP病情严重程度的一项指标。

    AP尤其是SAP是多因素参与的网格化变化过程,笔者仅分析了IL?8?251一个位点多态性。但在AP炎症反应中各细胞因子调节相当复杂,因此揭示各基因位点和各表现型之间的相关性,不仅要进行单个基因相关性的深入研究,而且要综合多基因位点进行分析才有可能对AP发生发展过程中遗传背景的所起作用有所了解。

【参考】
  /[1/]Mckay C J,Gallagher G,Brooks B,et al. Increased monocyte cytokine production in association with systemic complications in acute pancreatitis/[J/]. Br J Surg, 1996,16(83):919?923.

/[2/]中华医学会外会胰腺学组. 急性胰腺炎的临床诊断及分级标准/[J/]. 中华外科杂志, 1997,35(12):773?775.

/[3/]Leung T K,Lee C M,Lin S Y,et al. Balthazar computed tomography severity index is superior to Ranson criteria and APACHE Ⅱ scoring system in predicting acute pancreatitis outcome/[J/]. Word J Gastroenterol, 2005,11(38):6049?6052.

/[4/]张圣道. 重症急性胰腺炎临床新技术/[M/]. 北京:人民军医出版社, 2002:25?26.

/[5/]Taguchi A,Ohmiya N,Shirai K,et al. Interleukin?8 promoter polymorphism increases the risk of atrophic gastritis and gastric cancer in japan/[J/]. Cancer Epidemiol Biomarkers Prev, 2005,14(11):2487?2493.

/[6/]Gura T. Chemokines take center stage in flammatory ills/[J/]. Science, 1996,272(5264):954.

/[7/]Shokuhi S,Bhatia M,Christmas S,et al. Levels of the chemokines growth?related oncogene alpha and epithelial neutrophil?activating protein 78 are raised in patients with severe acute pancreatitis/[J/]. Br J Surg, 2002,89(5):566?572.