红芸豆红细胞凝集素单体的分离纯化和性质研究

【摘要】  目的 研究一种从红芸豆中提取红细胞凝集素单体(PHA-E)的新方法。方法 红芸豆经过浸提，离子交换树脂分离，分子筛层析纯化后得到PHA-E样品。采用电泳法测定其纯度、分子量和等电点。用2%人细胞悬液测定样品凝集红细胞的能力和影响凝血的因素，使用硫酸苯酚法测定其糖含量。结果 经PAGE分析PHA-E样品为单带电泳纯，SDS-PAGE上显示亚基分子量为32 kD，等电点为6.5.样品使人红细胞50%凝集的蛋白质最低浓度为4 μg/ml左右。单糖不影响PHA-E凝血活力，EDTA抑制其凝血活力，Zn2+促进其凝血。糖含量为8.1%.

【关键词】  红细胞凝集素 分离纯化 凝血 性质研究

    Abstract：Objective To study a new method for Erythrohemagglutinin（PHA-E）production from Phaseolus vulgaris.Methods PHA-E was purified from the excellent seeds of Phaseolus vulgaris by extraction，ion exchange chromatography and final gel filtration chromatography.The purity,the molecular weight and the isoelectric point of purified PHA-E were determined by electrophoresis.The ability and the influencing factor of agglutination were determined by 2% erythrocytes of human.Conclusion The purified PHA-E was single PAGE outline and had apparent subunit molecular weights of 32 kD by SDS-polyacrylamide gel electrophoresis.Isoelectric point of the PHA-E was 6.5.PHA-E can promote agglutination of human erythrocytes at 4 μg/ml,but its activity was not inhibited by any monosaccharide.EDTA can inhibit the ability of agglutination,and Zn2+ can accelerate it.The sugar content of PHA-E was 8.1%.

    Key words:erythrohemagglutinin；separation and purification；haemagglutination；characterization

      植物凝集素(Phytohemagglutinin PHA)是从豆科植物种子中提取的一种含糖蛋白质［1］。植物凝集素具有刺激外周血淋巴细胞RNA合成和有丝分裂［2］，促进免疫反应，使细胞凝聚，肿瘤细胞失活，以及诱发人外周血淋巴细胞产生抗癌淋巴因子等生物学活性。［3］报道PHA是由E、L两种亚基组成的四聚体蛋白质的混合物，按其亚基组成可分为L4、L3E、L2E2、LE3、E4具有相同物化性质和不同生物学活性的同工凝集素。其中PHA-E含有4个相同的E亚基，具有最强的红细胞凝集功能，没有白细胞凝集能力。由于凝集素单体较混合物PHA对于糖链具有更加特异的识别能力，可以作为分子探针，研究特异细胞膜受体的分布等，在免疫学、肿瘤、生殖生理、细胞生物学等许多方面得到应用，在医学、农业上呈现出巨大的应用前景。关于红细胞凝集素单体的分离纯化国内还未见报道，本研究改进和优化前人的提取和纯化方法，简化操作程序，从红芸豆中得到了凝血活力较高的电泳纯红细胞凝集素单体。

    1  材料与方法

    1.1  仪器与试药

    UV1102紫外－可见分光光度计（上海天美科技有限公司），蛋白质纯化系统（上海琪特仪器分析有限公司），高速冷冻离心机（Eppendorf公司），MINI-PROTEIN Ⅳ电泳系统（Bio-Rad公司）。

    红芸豆（购自甘肃兰州），低分子量蛋白标准（上海东风生物技术有限公司），蛋白质等电点标准（Pharmacia公司），两性电解质（pH 3～9，Pharmacia公司），PHA-E（Sigma公司），DEAE-Sepharose FF、CM-Sepharose FF、Sephadex G100（Pharmarica公司），乙酰氨基葡萄糖（Sigma公司），人红细胞悬液由本实验室自制，其它试剂均为国产分析纯。

    1.2  PHA-E提取过程

    1.2.1  PHA-E粗提液制备  将红芸豆粉碎，取100 g粉末，加入1000 ml的NaAc-HAc缓冲液(pH 5.2，20 mmol/L,0.14 mol/L NaCl),分四次磁力搅拌浸取。合并浸取液，后用两层纱布过滤。收集滤液，调pH 5.2，在4℃下10 000rpm离心10min，取上清液，即得PHA-E粗提液。

    1.2.2  CM-Sepharose层析  取CM-Sepharose装柱(2.6 cm×20cm)，用NaAc-HAc缓冲液（pH 5.2，20 mmol/L）平衡，将收集的PHA-E粗提液上柱。用Na2HPO4-NaH2PO4缓冲液（pH 6.0，20 mmol/L）冲洗至没有蛋白质流出，再用Na2HPO4-NaH2PO4缓冲液（pH 7.2，20 mmol/L）洗脱，收集蛋白质峰，调pH 7.2.

    1.2.3  DEAE-Sepharose层析  取DEAE-Sepharose装柱(2.6 cm×25 cm)，用Na2HPO4-NaH2PO4缓冲液(pH 7.2，20 mmol/L)平衡，将1.2.2收集得到的蛋白质峰上柱吸附，用缓冲液冲洗至基线平衡。用含0～0.4 mol/L NaCl的Na2HPO4-NaH2PO4缓冲液(pH 7.2，20 mmol/L)进行梯度洗脱，流速为5 ml/min，收集活性峰，装入透析带中，4℃冰箱中PEG浓缩。

    1.2.4  Sephadex G100层析  取1.2.3中的PEG浓缩液，上已经平衡好的Sephadex G100层析柱(2.6 cm×100 cm)，上样量为5 ml，用Na2HPO4-NaH2PO4缓冲液(pH 7.2，20 mmol/L)）进行洗脱，流速为2 ml/min，收集活性峰，用纯水透析除盐后，冻干，即得PHA-E单体。

    1.3  分析方法及性质研究

    1.3.1  凝血活力测定  按照文献方法［4］在微量V型血凝板上进行，用生理盐水倍比稀释凝集素，每孔含稀释液40 μl，加入2%人红细胞悬液40 μl，振荡混合，在25℃下放置2 h，肉眼观察结果，凝集活力以50%人红细胞凝集所需凝集素的μg数表示。

    1.3.2  PHA-E凝血活力影响因素测定  依上法，文献［5，6］，PHA-E倍比稀释后，每空加入20 μl，同时加入20 μl EDTA、二价金属离子或单糖等待测物质溶液，37℃下孵育1 h，用上述凝血活力测定方法进行评价。

    1.3.3  蛋白质含量测定  以牛血清白蛋白为标准，采用考马斯亮蓝G250测定方法［7］。

    1.3.4  蛋白质亚基分子量测定  参照文献［8］进行，使用不连续电泳（SDS-PAGE），凝胶浓度为12.5%，pH 8.3.考马斯亮蓝R-250染色。

    1.3.5  蛋白质等电点的测定  参照文献［8］进行，将样品和pH 3～10等电点标准在pH 3～9胶上进行电泳，经考马斯亮蓝R-250染色后，量取标准蛋白带和样品的泳动距离，测定样品的等电点。

    1.3.6  PHA-E纯度测定  参照文献［8］进行，使用不变性电泳PAGE，用PHA-E标准品做对照，测定其纯度。

    1.3.7  糖含量测定  方法［9］，以苯酚－硫酸法测定，以葡萄糖为参照物做标准曲线，求得值以0.9的系数修正。

    2  结果与分析

    2.1  PHA-E的提取

    文献［3］报道，PHA-E分子量为128 kD，等电点为pI 6.5.通过粗提取和CM-Sepharose层析，有效的除去了核酸和多数杂蛋白，将PHA-E主要集中在pH 7.2的Na2HPO4-NaH2PO4缓冲液中。洗脱液上DEAE-Sepharose柱后，梯度洗脱获得2个峰（见图1），其中蛋白质峰A具有较强凝血活力。收集峰A，浓缩后进行分子筛层析，得到两个峰（见图2），其中峰b具有凝血活力。收集峰b，透析脱盐，冻干后得到白色粉末，即为PHA-E纯品。

    2.2  凝血活力测定

    纯化得到的PHA-E产品，在微量V型血凝板上进行凝血活力测定。无凝集时红细胞沉于“V”图1  DEAE-Sepharose层析图

    Fig.1  Ion exchange chromatography of PHA-E on DEAE-Sepharose

    图2  Sephadex G100层析图

    Fig.2  Gel filtration of PHA-E on Sephadex G100

    型孔底部，呈一小圆点；凝集时红细胞相互聚集形成一片状，红细胞不下沉。不同的凝集程度用数字表示如下：O(不凝集)：红细胞全部沉积于“V”型孔底部，呈边缘清晰的小圆点；1(少许凝集)：沉积范围比半凝集大，未遍及全孔；2(半凝集)：部分沉积中部，周围有浑浊带，约占孔面积的50%；3(大部分凝集)：少许沉积于孔中心，沉积点边缘模糊；4(全凝集)：红细胞相互聚集形成一片网络，红细胞不下沉。凝集效价的判定以“2”作为终点。实验中PHA-E起始浓度为200 μg/ml，倍比稀释得到200 μg/ml～0.75 μg/ml浓度范围（1～9号孔）的样品，以生理盐水作为空白（10号孔），PHA-E标准品为对照（起始浓度为200 μg/ml,凝血活力为8 μg/ml），测得PHA-E的凝血活力为4 μg/ml.实验结果见图3和表1.表1  红细胞凝集结果示意图

    2.3  凝血影响因素

    结果见表2，葡萄糖、半乳糖不影响PHA-E凝血活性，EDTA抑制其凝血，Zn2+促进凝血。其他二价金属离子对PHA-E凝血活力未见明显影响。表2  EDTA、二价阳离子和单糖对PHA-E凝血活力的影响

　　2.4  电泳性质测定

    所得产品PHA-E在12.5%凝胶浓度的SDS-PAGE上表现为单带，分子量为32 kD电泳位置与标准品PHA-E一致(见图4)。在PAGE上表现为单带，位置与标准品一致，结果见图5。在IEF上表现为两条带，主带位置为pI 6.5，与标准品位置一致(见图6)。以上电泳分析证明，分离得到的产品PHA-E纯度达到电泳纯，电泳性质与标准品一致。

    3  讨论

    植物血细胞凝集素PHA是由五种四聚体糖蛋白组成的混合物，组成的蛋白质等电点在5.4～6.5之间。其中PHA-E的等电点最低，为pI 6.5。目前文献报道主要是通过亲和层析［10，11］、盐析和离子交换树脂结合［12］来进行凝集素的纯化。亲和层析提取PHA，然后再纯化得到各个单体，操作步骤虽然简单，但是亲和介质价格昂贵且重复使用率低，产品质量虽然很好，但是成本较高。普通生产采用离子交换树脂法，成本较低，但是在前处理阶段却需要盐析使蛋白质沉淀，而后透析脱盐，处理量大，步骤繁琐。

    本研究采用直接在阳离子交换层析柱上进行pH梯度的洗脱，在阴离子交换柱上进行盐浓度的洗脱。通过离子交换树脂的富集浓缩，达到了盐析法的效果，且纯化效果更好。离子交换层析处理上没有体积限制，也较传统方法更具备优势。产品经PAGE考马斯亮蓝R-250染色后得到单一的带，SDS-PAGE考马斯亮蓝染色显示一条分子量为32 kD的带，IEF电泳经考马斯亮蓝R-250染色后得到样品等电点为6.5,说明分离得到的红芸豆凝集素具有较高的纯度且与标准品吻合。PHA-E样品在血凝活性检测中，能使5O%人红细胞凝集的最低浓度约为4 μg/ml.

    PHA-E具备单一的凝血活性，能特异性的识别特殊糖链，因而在免疫诊断方面较PHA更具优势，纯化的红细胞凝集素可作为糖专一性探针，研究癌变细胞膜糖链结构和细胞变异的工具。

【参考文献】
  ［1］于敏,王志德,等.植物凝集素(PHA)的提取及血凝效果研究［J］.安徽技术师范学院学报.2002,16(1):23-25.

［2］Mahmoud Sitohy,Mahmoud Doheim,Haitham Badr.Isolation and Characterization of a Lectin with Antifungal Activity from Egyptian Pisum Sativum Seeds［J］.Food Chemistry,2007,10(3):971-979.

［3］丁邦裕,戴美红,余健.江苏菜豆同工凝集素的分离纯化及性质研究［J］.生物化学志.1991,7(1):25-27.

［4］孙册,朱政,莫汉庆.凝集素［M］.北京:出版社,1986：20-21.

［5］Nitsan,z.,Liener,I.E.Enzyme Acativities in the Pancreas.Digestive Tract and Feces of Rats Fed Raws or Heated Soybean Flour［J］.Nutr,1976,106:300-305.

［6］Won-Kyo Jung,Pyo-Jam Park,Se-Kwon Kim.Purification and Characterization of a New Lectin from the Hard Roe of Skipjack Tuna Katsuwonus Pelamis［J］.The International Journal of Biochemistry and Cell Biology,2003,35:255-265.

［7］杨建雄.生物化学与分子生物学实验技术教程［M］.北京:科学出版社，2002:35.

［8］郭尧君.蛋白质电泳实验技术［M］.北京:科学出版社，1999：54，123，161.

［9］张惟杰.复合多糖生化研究技术［M］.上海:上海科学技术出版社，1987：17.

［10］Tamao Endo. Fractionation of Glycoprotein-derived Oligosaccharides by Affinity Chromatography Using Immobilized Lectin Columns［J］.Journal of Chromatography A,1996,720:251-261.

［11］R.Reynoso-Camacho,E.Gonzalez de Mejia,G.Loarca-Pina.Purification and Acute Toxicity of a Lectin Extracted from Tepary Bean(Phaseolus Acutifolius)［J］.Food and Chemical Toxicology,2003,41:21-27.

［12］Kimiko ohtani,Satoaki shibata,Akira misaki.Purfication and Characterization of Tora-bean(Phaseolus Vulgaris)Lectin［J］.Biochem,1980,87:407-416