反复热性惊厥大鼠体内促炎症细胞因子水平的变化
【摘要】 目的:研究反复热性惊厥（febrile seizures，FS）大鼠海马IL-1β、IL-6 和TNF-α的变化特点，以探讨其在FS的病理生机制中的作用。方法:将大鼠随机分为：正常对照组（n=10，NC组），高热对照组（n=12，HC组）和热性惊厥组（n=21，FS组）。分别用ELISA和RT-PCR方法测大鼠海马IL-1β、IL-6和TNF-α蛋白和mRNA水平。结果:①FS组大鼠海马IL-1βmRNA和蛋白含量明显高于HC组（P<0.05或P<0.01）。FS组和HC 组大鼠海马IL-6和TNF-α的mRNA及蛋白含量比较差别均无统计学意义（P>0.05）。②海马IL-6含量与海马IL-1β含量之间存在正相关关系（r=0.536，P<0.01，n=24）。结论:IL-1β参与了FS的病理生理学改变，IL-6和TNF-α与FS相关脑损伤的产生过程无关。
【关键词】 惊厥 发热性 细胞因子类 大鼠
Abstract: Objective:To analyze the pattern of the inflammatory response to frequent febrile seizures (FS) and pathophysiological mechanism of FS in an experimental rat FS model. Methods: Rats were divided into 3 groups: normal control group (n=10, NC group ), hyperthermic control group (n=12, HC group) and febrile seizures group (n=21, FS group). IL-1β、IL-6 and TNF-α mRNA and protein levels in hippocampus of these rats were determined with RT-PCR and ELISA respectively. Results:①Significantly high level of IL-1βmRNA and protein in hippocamps were demonstrated in FS group compare with HC group（P<0.05 or P<0.01）. There were no significantly difference in hippocamps of IL-6 and TNF-α mRNA /protein level between FS group and HC group（P>0.05）.②Positive correlations were demonstrated between the level of IL-6 and IL-1β in hippocamps（r=0.536，P<0.01，n=24）. Conclusion:IL-1β may play a role in the pathophysiology mechanism of FS， but IL-6 and TNF-α may have no relation with the development of FS induced brain damage.
Key words: seizures; febrile; cytokines; rat
各种病理状态如癫、脑损伤等均可导致中枢神经系统（central nervous system，CNS）细胞因子产生增加，而脑部细胞因子水平的改变可导致神经细胞的损伤[1～6]。热性惊厥（febrile seizures，FS）是6个月至5岁儿童最常见的惊厥性疾病，大部分患者预后良好，约30%～40%的FS有可能复发，而反复FS发作可以造成脑损伤，遗留认知功能缺陷等后遗症，并且是癫发病的潜在危险因素[7，8]。我们采用热水浴建立大鼠反复FS脑损伤模型[9]，观察反复FS大鼠海马IL-1β、IL-6和TNF-α水平的变化，以探讨FS的病理生理学机制。
1 材料和方法
1.1 实验动物及模型建立 清洁级21日龄SD雄性大鼠（温州医学院实验动物中心提供），体重50～80 g，随机按10只、12只、21只的数目依次分为正常对照组（NC组）、高热对照组（HC组）和热性惊厥组（FS组）。各组动物处理同[9]：将FS组大鼠放置在45 ℃热水浴水槽（30 cm×30 cm×50 cm）内，水深以大鼠沿水槽壁站立时仅露出头部为准。大鼠在热水中浸浴直至诱发出惊厥，惊厥发生后，立刻转移至观察台上，即刻测量肛温（℃），同时记录大鼠惊厥潜伏期（s）、惊厥持续时间（s）及惊厥级别。隔天诱发惊厥1次，共10 次。HC组建立采用45 ℃温水定时（3 min）浸浴法，隔天一次，共10次，而无惊厥。记录大鼠出水槽时的肛温（℃）。
1.2 标本制备及检测
1.2.1 动物标本的采集：于末次热水浴后12 h处死动物。采取Hulse等[10]建立的乙醚麻醉法麻醉动物，断头后留取躯干血液，并剥离海马，液氮速冻，后转-80 ℃冰箱冻存。血清和左侧海马匀浆的制作同文献[9]。①血清：躯干血液静置15 min后，4 ℃离心20 min（3000 r/min），收集上清液-80℃冰箱冻存。②海马匀浆：取左侧冻存海马，按约1:10（W/V）比例加入生理盐水匀浆，匀浆液的离心、保存同血清。
1.2.2 ELISA法测定血清和海马匀浆中细胞因子的含量：大鼠TNF-α和IL-6 ELISA 试剂盒购自北京晶美生物工程有限公司；大鼠IL-1β（KRC0011）ELISA 试剂盒为美国BIOSOURCE 公司产品。操作严格按试剂盒说明书进行。
1.2.3 RT-PCR法进行海马细胞因子mRNA的半定量分析：按照TR-118（购自Molecular Research Center，Inc）说明书，使用Trizol提取总RNA，各样本RNA的含量经紫外分光光度计测定，其吸光值在OD260/OD280 的比值在1.7～2.0 之间。以Oligo dT Primer为引物进行总RNA逆转录反应，操作按BcaBESTTM RNA PCR Kit Ver.1.1（DRR023A，购自TaKaRa）试剂盒说明书进行，以β-Actin为内参照。各细胞因子和β-Actin的引物（由上海生工生物工程公司合成）和扩增条件见表1。扩增产物经溴化乙锭染色，使用1.6%的琼脂糖凝胶跑电泳，以100 bp DNA Ladder Marker（D505A，购自TaKaRa）作为标准参照，暗室紫外灯下观察产物片段的大小，同时借助FR-980生物电泳图像分析系统获取凝胶图像，用SmartView软件测定产物光密度值，用目的条带产物含量与β-actin产物含量之比表示组织中目的基因mRNA的含量。
1.3 统计学处理方法 多组样本均数比较采用单因素方差分析；均数的两两比较采用LSD法，方差不齐者采用Dennett检验。两变量的相关分析采用直线相关分析。
2 结果
2.1 动物模型 FS组大鼠（存活13只）共诱导0～Ⅱ级惊厥占0%，Ⅲ级惊厥占30%，Ⅳ级惊厥占47%，Ⅴ级惊厥占23%。平均惊厥潜伏期为（4.21±0.75）min；平均惊厥持续时间为（3.14±1.68）min；惊厥时平均肛温（42.87±0.50）℃。HC组（惊厥1只，死亡1只，予剔除，剩10只）大鼠出水的平均肛温为（42.76±0.57）℃，与FS组大鼠惊厥时的肛温相比差异无统计学意义（t=1.54，P=0.12）。NC组大鼠无一例死亡或惊厥。
2.2 海马细胞因子水平 见表2。
2.2.1 各组大鼠血清IL-1β、IL-6和TNF-α水平均未测出。
2.2.2 各组大鼠海马细胞因子mRNA及其蛋白水平比较：不同组间海马IL-1βmRNA及其蛋白水平均存在差异。FS组大鼠海马IL-1βmRNA及其蛋白水平均明显高于NC组和HC组大鼠。不同组间海马IL-6水平存在差异，FS组和HC组显著高于NC组，但FS组和HC组比较差异无显著性。各组大鼠海马IL-6 mRNA含量之间的比较无统计学意义。各组大鼠海马TNF-αmRNA及其蛋白水平比较差异无显著性。
2.2.3 相关分析：海马IL-6含量与海马IL-1β含量之间存在正相关关系（r=0.536，P<0.01，n=24）。海马TNF-α含量与海马IL-1β含量（r=0.010，P=0.957，n=29）、海马TNF-α含量与海马IL-6含量（r=0.228，P=0.273，n=25）之间不存在直线相关关系。海马 IL-1βmRNA 及其蛋白水平之间存在正相关关系（r=0.820，P=0.000，n=14）。大鼠海马IL-6（r=-0.158，P=0.663，n=10）及TNF-α（r=-0.047，P=0.878，n=13）的mRNA和蛋白之间均不存在直线相关关系。
3 讨论
众所周知，细胞因子是炎症反应和免疫反应的递质。大量研究发现各种途径（包括红藻氨酸、甲碘荷包牡丹碱和电刺激）诱发的边缘系统起源的癫模型大鼠脑组织IL-1β、IL-6和TNF-α的表达增加，且均与癫脑损伤的发生有关[1～6]。临床研究关于FS患者脑脊液中细胞因子水平的改变情况的结论常常相互矛盾。本实验通过建立了反复FS脑损伤模型，发现反复FS发病后12 h海马IL-1β表达上调，而IL-6和TNF-αmRNA 及其蛋白表达无明显改变。惊厥后细胞因子水平上调的机制还不明确，有人认为这种现象主要是继发于神经组织的损伤，然而大量的证据说明了癫发作本身会诱导细胞因子水平的上调[1～6]。
本实验发现，海马IL-1β mRNA水平和其蛋白水平之间存在正相关关系。故推测，FS可诱导海马IL-1βmRNA表达，从而使海马IL-1β含量升高；而对IL-6和TNF-α的表达无明显的影响。Heida 等[11]使用脂多糖＋海人藻酸制造FS动物模型，从惊厥发作开始到以后的2 h测得海马IL-1β的表达持续升高，与本实验结果类似。Schobitz等[12]发现IL-1β可增加CNS小胶质细胞和星形胶质细胞中IL-6和TNF-α的合成。本研究发现海马IL-1β含量与海马IL-6含量之间存在正相关关系，但与海马TNF-α含量之间无直线相关性。提示反复FS导致的海马IL-1β的上调可促进海马IL-6的合成（但未达到显著性意义），却不足以增加TNF-α的合成，故推测反复FS上调海马IL-1β表达的作用较弱。
有研究证实，细胞外IL-1β浓度的升高可导致神经元的损伤[13]，脑部IL-6长期处于高水平可出现神经元变性[14]，Shinoda 等[15]发现中和TNF-α抗体可减少KA 诱发惊厥后海马DNA损伤细胞的数量。大量研究发现癫模型中，大鼠各脑区细胞因子（IL-1β、IL-6和TNF-α）的表达增加的分布与脑损伤的区域是一致的，更有研究证实脑部IL-1β、IL-6和TNF-α的表达水平与脑损伤体积之间存在相关性[16]。Ravizza 等[1]发现KA诱导的惊厥也只对能诱导细胞因子（尤其是IL-1β）表达增加的脑组织才有神经元损伤作用。本实验提示FS可导致海马IL-1β表达的增加，同时发现FS 组大鼠海马CA1区神经元损伤[9]，故认为FS导致了IL-1β表达的上调，IL-1β参与了FS相关脑损伤过程。
IL-1β对神经元的损伤作用与其他细胞因子（IL-6和TNF-α）有协同效应，各种关键炎症级联反应分子的增加可加剧损伤后继发的神经元损伤[2]。本实验提示FS只引起海马IL-1β上调，而海马IL-6和TNF-α的表达无明显增加；相比较，癫可导致以上三种促炎症细胞因子广泛的表达增加[1～6]，提示与其他因素诱导的癫发作相比，FS对海马促炎症细胞因子水平的影响可能较小，故推测这是FS对神经元存活率影响较小的原因之一。此外脑部TNF-α、IL-6和IL-1β含量增加还可改变惊厥易感性[17～19]，故反复FS引起海马细胞因子表达的增加可能成为癫发作的潜在因素。
研究发现年龄较大的小鼠脑部TNF-α、IL-6 和IL-1β的基础表达水平较年轻小鼠高，脑损伤后大龄小鼠丘脑TNF-α和IL-1β基因表达水平明显高于年轻小鼠[3]。Ravizza等[1]发现在9日龄大鼠使用KA诱发惊厥后未发现细胞因子表达增加；15日龄大鼠使用KA诱发惊厥后只可诱导IL-1β 表达增加；而21日龄大鼠使用KA诱发惊厥后可导致所有细胞因子（IL-1β、IL-6和TNF-α）的表达增加，与成年鼠大脑类似[2]。这说明随着年龄的增长，特定的细胞因子在基础状态和损伤后的表达水平均增加。本实验结果发现反复FS可导致海马神经元的损伤；也导致海马IL-1系统表达增加，而IL-1系统表达上调的幅度可能随着FS复发时年龄的增长而逐渐增大，故对海马神经元的损伤作用也会逐渐加重，因此早期防治FS的复发对脑正常发育很重要。
综上所述，IL-1β参与了FS的病理生改变，IL-6和TNF-α很可能与FS病理生理学过程无关。
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