激活素A和卵泡抑素对冻融人胎儿卵巢雌二醇分泌的影响

               作者：池海虹，周颖，祝怀平，金畅，叶碧绿  

【关键词】  激活素A；卵泡抑素；胎儿；卵巢；雌二醇

    Abstract:  Objective:To investigate the effect of Activin A-follistatin on steroidogenesis of frozen-thawed human fetal ovary in vitro. Methods: The frozen-thawed fetal ovarian tissue was cultured individually in minimal essential medium (MEM) for 8 days. Under the experimental conditions, the medium was supplemented with either Activin-A (Act A group) or follistatin (FS group) or the combinations of Activin-A and follistatin (A+F group). The concentration of E2 in cultured medium was detected with immunoluminescence method. Results: The levels of E2 at 4th day, 6th day and 8th day were higher than that at 2nd day (P<0.05), The secretion of E2 increased at first, then decreased with the highest level at 6th day. The level of E2 of Act A group was significantly greater than that of the control group, FS group and A+F group (P<0.01). Conclusion: Frozen-thawed human fetal ovary can excrete estrodiol under the condition of tissue culture. Act A can increase the excretion of estrodiol in cultivated ovarian tissue, and the effection of Act A can be suppressed by FS.

    Key words:  activin A; follistatin; fetal; ovarian tissue; estrodiol

    近年来发现的一组性腺起源的细胞因子--激活素(Activins)，对卵泡发育有着重要的局部调节作用，尤其是激活素A(Activin A，Act A)。尽管有较多的研究表明了激活素对不同动物卵泡发育的影响[1-3]，但对人胎儿卵巢内卵泡发育的影响尚未见报道。本研究以胎儿卵巢为研究对象，比较Act A和卵泡抑素(FS)在体外组织培养条件下对冻融人胎儿卵巢E2分泌的影响，探讨其在人卵泡发生过程中可能的调节作用。

    1  材料和方法

    1.1  标本  卵巢组织取自因计划生育或医疗原因需行药物引产（利凡诺＋米菲司酮）的32周胎儿（温州医学院教学分娩室提供）共3例，于引产后2 h内无菌条件下取材，置于预冷的Leiboviz-15(L-15，美国sigma公司产品)基础培养液中待用。本研究经我院伦理委员会批准。

    1.2  试剂和仪器  基础培养液为MEM培养液(购自GIBCO公司)，含5%小牛血清，100 U/ml的FSH, 100 IU/ml青霉素和100 IU/ml链霉素，1/100 ITS(胰岛素-转铁蛋白-硒，insulin-transferrin-selenium)，pH 7.0～7.2。Act A、FSH、FS均为Sigma公司产品。E2测定采用美国贝克曼库而特公司BXI800仪器及试剂。

    1.2  实验方法

    1.2.1  冷冻及复苏: 将胎儿卵巢组织去除髓质及周围结缔组织后，切成5 mm×5 mm×1 mm大小，放入装有冷冻保护剂1.5 mol/L丙二醇（PROH）的冷冻管中，按照Oktay[4]提出的慢冻速融法处理。

    1.2.2  体外培养及分组:冻融卵巢皮质块切成2 mm×2 mm×1 mm大小，随机放入加有0.8 ml培养液的24孔培养板内，37 ℃、5%CO2培养箱内培养，隔天半量换液，共培养8 d。实验共分四组：MEM组（Minimum Essential Medium，基础培养液）即对照组、Act A组（基础培养液+100 ng/ml Act A）、FS组（基础培养液+100 ng/ml FS）和A+F组（基础培养液+100 ng/ml Act A+100 ng/ml FS）；每组4块组织。所有实验重复3次。

    1.2.3  E2的测定: 收集培养2 d、4 d、6 d、8 d的培养液，采用免疫发光法，按美国贝克曼库而特公司BXI800仪器及试剂说明测定E2的含量。质控符合要求,批内变异系数<10%，批间变异系数<15%。

    1.3  统计学处理方法  采用重复测量资料方差分析进行比较，采用Dunnet进行两两比较。

    2  结果

    所有培养组的卵巢组织，培养4 d、6 d、8 d分泌的E2值均高于2 d值，差异有显著性（均P＜0.05），总体呈先增加后减少改变，在培养后6 d可达较高水平；Act A组E2分泌量明显高于对照组、FS组和A+F组，差异有显著性（均P＜0.01），详见表1。

    3  讨论

    3.1  胎儿卵巢组织体外培养条件下能分泌E2  本实验结果显示，胎儿卵巢组织在体外培养条件下能产生E2。目前，国内外对卵巢组织体外培养的最佳时间尚无定论，除鼠卵巢组织外，其他哺乳动物的卵巢组织即使体外培养20 d，组织内的初级卵泡也不能发育到次级卵泡阶段[5]。本研究中E2分泌量随培养时间延长先增加后减少，在培养后6 d可达较高水平，这是否提示人胎儿卵巢组织的体外最佳培养时间为6 d尚有待进一步研究。

    3.2  Act A和FS对卵巢组织E2分泌的影响  Act A是最早在性腺发现的糖蛋白激素，属于转化生长因子(transforming growth factor，TGF)β超家族成员。1986年首次从猪的卵泡液中分离、纯化，根据其具有特异性地促进垂体细胞分泌、合成卵泡刺激素（Follicle stimulating Hormone，FSH）的生物学活性而得名[6]，主要以旁分泌和自分泌途径发挥生物活性。目前的研究认为，Act A是一种调节组织细胞功能的基本介质，具有广泛的生物学活性，参与调节颗粒细胞的增殖和分化、类固醇激素的产生[7]，支持卵泡生长并抑制卵泡闭锁[8]。近年来， 在人卵泡颗粒细胞上也发现了Act A的受体[9]。本研究结果显示，Act A对卵巢组织类固醇激素的分泌有促进作用，Act A处理组的E2分泌量较对照组明显增加。其促进E2分泌的机制可能为，Act A诱导卵泡颗粒细胞形态变化，并通过增加颗粒细胞上FSH的受体水平及结合位点，使FSH的生理作用增强[10]，后者能刺激芳香化酶活性，增加E2的生成。

    FS是一种主要由多种垂体细胞和卵巢颗粒细胞分泌的单聚体糖蛋白，1987年首次从牛卵泡液中提取出来，能抑制FSH分泌。在本实验中，FS组与对照组相比，E2分泌量无明显差异，说明FS单独使用未对卵巢E2的分泌产生影响。

    FS在结构上与Act A无关联，但可通过与Act A的不可逆结合，间接抑制颗粒细胞芳香化酶的活性、抑制垂体FSH分泌并下调未分化颗粒细胞FSH受体的表达，拮抗Act A对卵泡的作用[11]。在对羊FS表达的研究中发现，FS蛋白存在于羊原始卵泡的卵母细胞和初级、次级卵泡的卵母细胞和颗粒细胞中，但mRNA仅在次级卵泡的颗粒细胞中检测到，因为Fs结合并中和了Act[12]，这说明在早期卵泡发育中，FS可能调控了Act A的生物活性。本实验结果显示，A+F组E2分泌量明显低于Act A组，提示FS可能拮抗了Act A对卵巢E2分泌的促进作用。朱辉等[13]在对离体大鼠卵泡体外培养实验中，也观察到相同的效应。

【】
  [1] Vanderhyden BC, Macdonald EA, Nagyova E, et al. Evaluation of Members of the TGF-beta Superfamily as Candidates for the Oocyte Factors That Control Mouse Cumulus Expansion and Steroidogenesis[J].Reprod Suppl,2003,61(1):55-70.

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[3] Shidaifat F,Khamas M, Hailat N. Activin-a Differentially Regu-lates Steroidogenesis by Sheep Granulosa Cells[J]. Res Vet Sci,2001,71(1):23-25.

[4] Oktay K, Newton H, Aubard Y, et al. Cryopreservation of Immature Human Oocytes and Ovarian Tissue: An Emerging Technology [J]. Fertil Steril,1998,69(1):1-7.

[5] Fortune JE, Kito S, Wandji SA,et al. Activation of Bovine and Baboon Primordial Follicles in Vitro[J]. Theriogenology,1998,49(2):441-449.

[6] Vale W, Rivier J, Vaughan J, et al. Purification and Character-ization of an Fsh Releasing Protein from Porcine Ovarian Follicular Fluid[J]. Nature,1986,321(6072):776-779.

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[8] Matin SJ, Bayne RA, Cambray N, et al. Expression of activin subunits and receptors in the developing human ovary: activin A promotes germ cell survival and proliferation before primor-dial follicle formation. [J]. Dev Biol, 2004,266(2):334-345.

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[10] Zhang YQ,Kanzaki M,Mashima H,et al.Norepinephrine Re-verses the Effects of Activin A on DNA Synthesis and Apoptosis in Cultured Rat Hepatocytes[J]. Hepatology,1996 ,23(2):288-293.

[11]Lin SY, Morrison JR, Phillips DJ, et al. Regulation of Ova-rian Function by the TGF-Beta Superfamily and Follistatin[J]. Reproduction,2003,126(2):133-148.

[12] Sidis Y, Tortoriello DV, Holmes WE. Follistatin-related pro-tein and follistatin diferentially neutralize endogenous ver-sus exogenous activin[J]. Endocrinology, 2002, 143(1): 1613-1624.

[13] 朱辉, 刘国艺, 李庆雷,等. 激活素A 对离体培养大鼠卵泡发育的影响[J]. 基础医学与临床,2001. 21 (6):560-562.