尼莫地平抗急性铅染毒大鼠海马神经元损伤的形态学研究
作者：黄陈平，林林，宋明芬，方周溪
【摘要】 目的:了解尼莫地平对急性铅染毒大鼠海马神经元损伤的干预作用。方法:48只2月龄SD大鼠随机等分为4组，即染铅组（40 mg/kg PbAc）、尼莫地平组(1 mg/kg Nim)、铅-尼莫地平组(40 mg/kg PbAc +1 mg/kg Nim)和对照组（等量生理盐水），每日腹注1次，连续3 d。用TUNEL法原位检测海马神经元凋亡情况，并用电镜观察海马神经元超微结构变化。结果:各组海马神经元凋亡指数由高到低依次为染铅组、铅-尼莫地平组、对照组和尼莫地平组，染铅能显著增高海马神经元凋亡指数(P<0.01)，尼莫地平与铅存在交互作用(P<0.01)，在铅染毒的前提下，尼莫地平能明显降低神经元凋亡指数。电镜观察显示，染铅组海马神经元有核固缩现象，而铅-尼莫地平组神经元未见明显异常。结论:急性铅染毒能引起海马神经元损伤，促进细胞凋亡；尼莫地平可能具有抗急性铅染毒海马神经元损伤的作用。
【关键词】 铅；尼莫地平；海马神经元；急性中毒；大鼠
Abstract: Objective: To study the protective effect of nimodipine (NIM) on hippocampal neurons in rats acutely exposed to lead (Pb). Methods: 48 rats of 2 months old were randomly divided into four groups: Pb group (40 mg/kg PbAc), NIM group (1 mg/kg Nim), Pb-NIM group (40 mg/kg PbAc + 1 mg/kg Nim) and control group. The treating rats were respectively administered intraperitoneally with lead acetate or/and nimodipine qd for 3 days. The control rats were given equal volume of 0.9% saline. The hippocampus was removed for electron microscopic examination and the neuron apoptosis was tested by TUNEL method. Results:The index of neuron apoptosis in hippocampus varied among different groups. The order of apoptosis index was as follow: Pb group＞Pb-NIM group＞control group＞NIM group. The rats exposed to lead significantly enhanced the neuron apoptosis (P＜0.01). There was significant interaction on the neuron apoptosis between factors of Pb and NIM (P＜0.01). Under exposure to lead, nimodipine could significantly reduce the index of neuron apoptosis. Electron microscopy showed that degenerative changes, such as pyknosis occurred in hippocampal neurons of Pb group. But there were no obviously degenerative changes observed in hippocampal neurons of Pb-NIM group. Conclusion:Acute exposure to lead may damage hippocampal neurons and then induce morphological changes such as apoptosis. Nimodipine may have protective effects on degenerative hippocampal neurons induced by acute lead poisoning.
Key words: lead；Nimodipine；hippocampal neuron；acute poisoning；rat
铅是常见的环境污染物，是公认的儿童认知功能发育障碍的主要危险因素之一。小剂量铅就能损害中枢神经系统，尤其在脑海马回，这种损害在神经发育的初期最为敏感[1]。目前铅对中枢神经系统损害的机制尚不清楚，有研究显示，小剂量Pb2+就可促使体外培养的小脑颗粒细胞发生凋亡，而钙离子通道阻断剂能抑制其作用[2]。我们通过动物实验，观察急性铅染毒诱发神经细胞凋亡的情况及钙离子通道拮抗剂尼莫地平的干预作用，以探索铅对神经系统损害的机制及铅中毒的防治方法。
1 材料和方法
1.1 实验动物及分组 健康2月龄SD大鼠48只（上海斯莱克实验动物有限责任公司提供，清洁级，许可证号：SCXK（沪）2003-0003），雌雄各半，始重为（170.7±8.0）g，按性别、体重配伍，随机分为4组，每组12只，按照2×2析因设计安排实验因素铅和尼莫地平，即染铅组、尼莫地平组、铅-尼莫地平组和对照组。染铅组大鼠按40 mg/kg腹腔注射醋酸铅（配成1%醋酸铅溶液），尼莫地平组按1 mg/kg腹腔注射尼莫地平（0.02%尼莫地平注射液，德国拜耳公司），铅-尼莫地平组按每公斤体重腹腔注射醋酸铅40 mg和尼莫地平1 mg，对照组不予以醋酸铅或尼莫地平，但按单位体重予以1%醋酸铅等量的生理盐水腹腔注射。各组大鼠每日腹腔注射1次，连续3 d。末次注射后24 h，大鼠用戊巴比妥钠50 mg/kg腹腔注射麻醉，行主动脉插管，开放右心耳，用含肝素的生理盐水冲洗后，4 ℃的4%多聚甲醛PBS溶液灌注固定，开颅取脑，置4%多聚甲醛PBS溶液中继续固定12 h。
1.2 脑海马神经元凋亡原位检测 采用末端脱氧核苷酸转移酶介导的dUTP缺口末端标记(TUNEL)法，试剂盒购自北京中杉公司。经脑漏斗部横切取得脑片，常规脱水、石蜡包埋，制成5μm厚组织切片，脱蜡至水，PBS冲洗，滴加TUNEL反应混合溶液，在湿盒中37 ℃孵育60 min，PBS冲洗后，加少许羊血清进行封闭，沥干后加转化剂-辣根过氧化物酶（POD），37 ℃孵育30 min，PBS冲洗，滴加DAB底物溶液，室温孵育10 min，冲洗后用苏木素复染，洗片后脱水封片。选择细胞凋亡指数作为评价指标，即在1 000倍显微镜（Nikon Eclipse 50i）下，每张玻片随机拍摄脑海马CA区（1～4）和DG区5个不连续视野，凋亡神经元占总神经元比例。
1.3 脑海马神经元电镜观察 各组随机取2只动物，脑海马组织取材后，戊二醛-锇酸双重固定，环氧树脂包埋，超薄切片，用日立H-7500透射显微镜进行观察。
1.4 统计学处理方法 计量资料以均数±标准差(±s)表示，数据用SPSS14.0软件进行分析，铅及尼莫地平对凋亡指数的交互效应选用2×2析因设计方差分析，各组单独作用比较采用完全随机设计方差分析。
2 结果
2.1 一般情况 实验初期，各组大鼠体重无显著差异，平均为(170.7±8.0)g。在实验后期，染铅组和铅-尼莫地平组大鼠体重[分别为(152.3±7.6)g和(151.2±10.5)g]较对照组和尼莫地平组[分别为(185.5±12.9)g和(186.6±10.0)g]有明显下降（P<0.01）。
2.2 海马神经元TUNEL染色观察 光镜下，海马CA区为锥体细胞层，DG区为颗粒细胞层，TUNEL阳性神经元的胞核呈棕色，染色质多浓缩于核膜下呈指环状，有核固缩和核碎裂现象，胞浆中因有核碎片亦可着色。各组海马神经元凋亡指数由高到低依次为染铅组、铅-尼莫地平组、对照组和尼莫地平组，铅-尼莫地平组凋亡指数较单纯染铅组为低(P<0.01)，但显著高于对照组和尼莫地平组(P<0.01)。析因分析显示铅与尼莫地平在神经元凋亡指数上存在明显的交互作用(P<0.01)，即尼莫地平能显著减轻铅引起的神经元凋亡作用。与对照组比较，单纯尼莫地平组细胞凋亡指数有下降趋势，但尚无统计学意义，表明在正常情况下尼莫地平尚不能显著降低神经元的凋亡率。见表1、图1。
2.3 海马神经元超微结构观察 对照组和尼莫地平组神经元胞浆有多量粗面内质网，核糖体分布均匀，核膜完整，神经突起结构清晰。染铅组神经元细胞器结构基本正常，细胞器分布较稀疏，粗面内质网有脱颗粒现象，核中染色质在核膜下聚集，核有固缩现象。铅-尼莫地平组神经元细胞器结构基本正常，粗面内质网增多，细胞核未见异常。见图2。
3 讨论
铅对神经系统的毒作用可能是多方面的，包括引起神经细胞凋亡、兴奋性神经毒作用、脂质过氧化损伤、影响神经递质贮存和释放、干扰线粒体能量代谢等[3，4]。目前，尚不能用单一的毒理机制来统一解释各种铅毒作用。铅在体内的代谢与钙相似，铅能够取代钙，扰乱细胞内正常的钙稳态和信使作用，最终导致细胞的损伤和功能的失调，这是多种铅毒作用机制中较为普遍和重要的环节。Pb2+主要通过钙通道进入神经细胞内，细胞内Pb2+持续增加以及胞内钙稳态失衡（主要表现为钙超载），触发了线粒体膜转运孔的开放，引起线粒体去极化，启动细胞色素C-caspases 级联反应而导致细胞凋亡的发生[5]。李丹等[6]报道大鼠海马神经元凋亡率与染铅剂量间有良好的剂量-反应关系。本研究结果也显示，染铅组海马神经元凋亡率较对照组显著增高，电镜下神经细胞核染色质聚集，并有固缩现象。这证实了急性染铅毒能引起海马神经元损伤，具有促进细胞凋亡的作用。
铅可作用于电压门控性和受体依赖性Ca2+通道,铅对电压门控性Ca2+通道影响更明显[7]。电压门控性Ca2+通道分为L、N、T、P四种亚型，其中L型是主要的。在钙通道中，Pb2+与Ca2+有一个高度特异性的竞争位点，铅可以通过与Ca2+竞争进入细胞内，但胞内Ca2+浓度并不一定降低。研究提示细胞内微量Pb2+即可激活PKC，后者可激活细胞膜、内质网、线粒体的钙通道，使胞外Ca2+内流，胞内钙库释放，导致胞内Ca2+浓度增高[8]。Ca2+通道存在一个Ca2+依赖性失活机制，即通过细胞内Ca2+水平反馈调节钙通道活性，防止因过多Ca2+流入使细胞内Ca2+超载，而铅对这种反馈机制的影响可导致胞内Ca2+浓度持续增高，进一步引起神经细胞损伤或凋亡[9]。L型钙通道拮抗剂尼莫地平是新一代二氢吡啶类钙通道拮抗剂，它极易通过血脑屏障，主要分布在皮层和海马，作用于二氢吡啶受体，引起受体构型发生改变，使Ca2+通道稳定在不活动状态，从而阻断钙内流，有效地调节细胞内钙的水平，使之保持正常的生理功能。它具有改善脑循环，并直接作用于神经元，有易化学习、改善记忆的作用，且副作用轻微，临床上常作为促智药，目前主要用于痴呆症，但尚无关于用尼莫地平治疗铅中毒智力损伤的报道。Tomsig等[10]报道在体外试验条件下，二氢吡啶类钙通道拮抗剂能减少胞外Pb2+经Ca2+通道进入胞内。濮海平等[11]在新生鼠非铅毒性脑损伤后细胞凋亡情况及尼莫地平干预作用的研究中，发现尼莫地平干预能显著减轻脑细胞凋亡。在本研究中，单纯用尼莫地平对神经元凋亡的改善作用并不明显，但在急性铅染毒的基础上，尼莫地平具有显著抑制铅诱导的神经细胞凋亡作用。
综上所述，急性染铅毒能引起海马神经元损伤，促进细胞凋亡；尼莫地平可能具有抗急性铅染毒海马神经元损伤的作用。
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