各期慢性阻塞性肺疾病患者诱导痰中细胞成分与肺功能的关系
作者：曾勉, 刘凌云, 张式鸿, 谢灿茂, 王 辉, 黄晓梅
【摘要】 【目的】 比较不同时期慢性阻塞性肺病（COPD）患者诱导痰中细胞组成的变化，及其诱导痰中细胞成分尤其中性粒细胞百分比与气流受限的关系。【方法】 对110例COPD患者［急性加重期COPD (AECOPD) 患者（A1组）62例、稳定期COPD患者（B组）48例］及30例健康对照者（C组）进行肺功能测定及痰诱导，痰液处理后沉渣作细胞学分析。其中AECOPD组在1周后（A2组）再次进行上述指标的测定。【结果】 140例受试者中有21例因不能耐受痰诱导过程或痰标本不合格而退出研究，最终有119例受试者完成本研究（A1,2组48例，B组43例，C组28例）。A1组、A2组、B组、C组诱导痰中细胞总数（10 6/ml）分别为（8.8 ± 3.7）、（6.5 ± 2.6）、（5.0 ± 2.8）、（2.8 ± 1.3），细胞分类中A1组、A2组、B组以中性粒细胞为主，分别为（66 ± 15）％、（60 ± 10）％、（55 ± 11）％，而在C组中则以巨噬细胞、中性粒细胞为主，分别为（37 ± 10）％、（32 ± 8）％；AECOPD患者（A1组、A2组）诱导痰中性粒细胞百分比与肺功能指标（FEV1、FEV1％pre、FVC、FEV1/FVC）呈负相关（r分别为-0.860、-0.682、-0.662、-0.300，P < 0.001）；稳定期组（B组）中性粒细胞与FEV1、FEV1％pre负相关（r分别为-0.346 、-0.421, P < 0.05），对照组中性粒细胞与肺功能无相关性(P > 0.05)。【结论】 AECOPD、缓解期、稳定期患者诱导痰细胞以中性粒细胞为主，健康者诱导痰细胞以巨噬细胞为主；气道局部中性粒细胞增多与各期COPD患者气流受限存在密切的关系。
【关键词】 阻塞性肺疾病；诱导痰；中性粒细胞
慢性阻塞性肺疾病（chronic obstructive pulmonary disease, COPD）是一种以不完全可逆的气流受限为特征的疾病，与肺部对有害气体或有害颗粒的异常炎症反应有关[1]。由不同炎性细胞、炎症介质和细胞因子介导的慢性气道炎症，会进一步引发气道阻塞和气道重构，对COPD发生起着重要作用。已证实诱导痰法是一种非侵入性、安全、简便易行直接测定气道炎症的方法，已广泛用于哮喘的临床研究及诊治中，近年来，诱导痰技术在COPD气道局部炎症机制研究中的应用越来越受重视，其安全性和有效性也得到证实[2,3]。但目前较多关注的是诱导痰中炎症因子、炎性介质在COPD中的作用，而诱导痰中细胞成分的变化及其与各期COPD气流受限的关系研究报道较少，尤其COPD急性加重期诱导痰细胞学分析未见报道。我们通过观察COPD急性加重期、缓解期和稳定期患者及健康对照组诱导痰中的细胞总数及细胞分类的变化，及其与肺功能的关系，来阐明气道局部炎症细胞在COPD中的作用。
1 材料和方法
1.1 研究对象
收集2004年10月至2006年03月中山大学附属第一呼吸科门诊及住院的110例COPD患者及30例健康对照组（C组）。COPD患者中急性加重期患者（A1组）62例，COPD稳定期患者（B组）48例。缓解组（A2组）指上述AECOPD组病人经正规治疗1周后临床症状缓解者。稳定期组（B组）病人指患者咳嗽、咳痰、气促等症状稳定或症状轻微持续2个月以上者；2周内无呼吸道感染，未使用全身激素及抗生素。健康对照组（C组）：选择年龄匹配（年龄±2)，非呼吸系统疾病的健康人群。纳入标准：所有COPD患者均符合COPD全球创议（GOLD）[1,4]的诊断标准（支气管舒张试验后FEV1<80%预计值，FEV1/FVC < 70%）。AECOPD患者均符合ATS/ERS的AECOPD诊断标准［2,4］。排除标准：除外哮喘、支气管扩张、肿瘤、结缔组织病、糖尿病、甲状腺功能亢进等疾病。合并高血压病、严重左、右心功能衰竭（心功能Ⅲ、Ⅳ级）者不纳入研究范围。凡符合入选标准的患者告知本研究的目的及试验方法，签署知情同意书。
1.2 研究方法
根据Pin等的改良方法，我们制定了痰诱导及痰液处理规范操作流程[2]。受试者在诱导前测定FEV1，然后吸入200 μg沙丁胺醇，15 min后测定FEV1作为基础值，在室温下CSW-1型超声雾化器（汕头光电研究所，标准号YY/TO109-93）吸入3％高渗盐水2 min后，用双氧水漱口，深咳痰液入无菌容器中；继续吸入3％高渗盐水，间隔3 min测FEV1和连续监测脉搏血氧饱和度（SpO2），收集痰液至少1克以上。取无唾液成分的痰液放入离心管中，加入4倍体积的0.1％DTT孵育，螺旋振荡15 min，3 500 r / min (r=15 cm)，离心20 min。沉淀细胞用Hank’s液悬浮，在血细胞仪上计数细胞总数，用台盼蓝（Trypan）排除法测定细胞是否存活及存活率，细胞存活率>50％为合格标本。调节细胞悬浮密度至1×106，将75 μl悬浮液置于细胞离心机,450 r/min (r=15 cm)，离心6 min，细胞沉渣涂片，风干，吉姆萨染色，每张涂片计数400个非鳞状上皮细胞分类，鳞状上皮细胞＜ 20％者为合格标本，提示痰来源于下呼吸道，并对细胞进行计数和分类。COPD患者的舒张试验及所有受试者的肺功能使用肺功能仪（Sensor Medics Ltd, USA）进行测定。痰诱导过程中监测FEV1采用便携式肺功能仪（Micro Medical公司，英国），SpO2用便携式脉搏容积血氧饱和度仪（Osaka公司，日本）。
1.3 统计学处理
各组数据以均数±标准差（ｘ±ｓ）表示，各组均数比较采用单因素方差分析（ANOVA）、组间两两比较用SNK-q检验，方差不齐者采用秩和检验，粒细胞数与肺功能的关系用Spearman相关分析；所有数据的计算、统计分析用SPSS 13.0软件处理，以 P ＜ 0.05为差异有统计学意义。
2 结 果
2.1 患者一般情况和肺功能分级
入选的的110例COPD患者均符合COPD中-重度标准。其中AECOPD患者62例，稳定期患者48例，健康对照组30例。
62例AECOPD患者入院当天和1周后（缓解期）分别进行痰诱导，其中有14例患者不能耐受痰诱导过程或痰标本不合格而退出研究，最终顺利完成痰诱导且痰标本合格患者有48例；48例稳定期组(C组)退出研究5例，顺利完成痰诱导且痰标本合格患者43例；30例对照组（C组）纳入研究有28例，2例因痰标本不合格而退出。各组性别、年龄、FEV1、FEV1占预计值％和FEV1/FVC等数值详见表1。
四组间性别、年龄无差异（P ＞0.05）；AECOPD治疗前后肺功能的比较差异有统计学差异，P<0.01，治疗后，肺功能明显改善。四组间FEV1和FEV1占预计值％的差异有统计学意义，P< 0.01，稳定期肺功能好于缓解期，缓解期好于加重期（表1）。
2.2 各组诱导痰液的细胞分类情况
对照组诱导痰细胞分类中，巨噬细胞占（37.1 ± 9.8）%，明显高于中性粒细胞、淋巴细胞和嗜酸性粒细胞、上皮细胞比例；各期COPD中性粒细胞比例明显高于其他细胞比例，随着病情的好转，肺功能改善，由加重期、缓解期、稳定期痰液中性粒细胞计数依次下降，但仍高于对照组，P < 0.05。而淋巴细胞、嗜酸性细胞变化不大（表2）。
2.3 诱导痰细胞成分与肺功能的相关性
各组诱导痰中性粒细胞比例与FEV1、FEV1％pre、FVC、FEV1/FVC的相关性见表3。从表3可见AECOPD（A1、A2组）中性粒细胞与FEV1、FEV1％pre、FVC、FEV1/FVC皆呈显著负相关（r分别为-0.860、-0.682、-0.662、-0.300，P < 0.001）；COPD稳定期组（B组）中性粒细胞与FEV1、FEV1％pre、FVC、FEV1/FVC也呈负相关，但相关性不如AECOPD组；各组散点具线形趋势。对照组中性粒细胞比例与肺功能各指标无相关性，P >0.05。
3 讨 论
COPD是多种炎症细胞和炎症介质参与的气道炎症。通过诱导排痰法检测有关炎症细胞和介质指标，阐明局部气道炎症与气流受限的关系，已证实是一种非侵入性、简便可行的新方法[2]。诱导痰标本是否来自下气道、痰标本是否合格主要通过诱导痰的细胞学检查来判断，目前常用的标准是[５]：每低倍镜视野下痰标本的白细胞数 ＞25个、鳞状上皮细胞＜ 10个，吉姆萨染色后每张涂片计数400个细胞其中鳞状上皮细胞＜ 20％且细胞存活率 ＞50％为合格标本。本研究亦采取此标准为判断痰标本是否合格的标准。结果显示9例痰标本细胞存活率＜ 50％而退出研究。
诱导痰的来源与自发排痰、支气管肺泡灌洗液、支气管活检的部位不同，主要来源于外周气道至中央气道的分泌物，反映了气道分泌物状态下的浓度，具有更集中的细胞和生化物质成分，尤适合气道炎症疾病如COPD、哮喘的研究。健康人及不同呼吸道疾病其诱导痰细胞分类的比例存在明显的差异，反映了不同疾病发病机制的差异。健康人群诱导痰中以巨噬细胞、淋巴细胞、中性粒细胞为主，哮喘患者诱导痰中以嗜酸性粒细胞和巨噬细胞为主[6]，而COPD患者诱导痰中则以中性粒细胞为主[7]。我们的研究中还发现COPD急性加重期、缓解期、稳定期诱导痰中均以中性粒细胞为主，分别为（66.1 ± 15.1）％、（60.3 ± 10.0）％、（55.3 ± 11.7）％，嗜酸性细胞变化不大，健康对照组中则以巨噬细胞、中性粒细胞为主，分别为（37.1 ± 9.8）％、（31.7 ± 8.1）％，但中性粒细胞比例不如COPD高，与Balzano[8]及O’Donnell[9]的结果基本类似。本研究发现各期COPD的中性粒细胞的百分比与FEV1、FEV1％pre、FVC、FEV1/FVC呈负相关，以加重期组相关性更明显，对照组中性粒细胞与肺功能无相关。本研究COPD加重期中性粒细胞明显增高，经治疗症状缓解后，诱导痰的中性粒细胞虽有明显下降［从（66.1 ± 15.1）％降至（60.3 ± 10.0）％，（P < 0.05）］，但其数值仍高于对照组，稳定期中性粒细胞数也明显高于对照组（P < 0.05），提示中性粒细胞不仅在COPD加重期对气道炎症及气流受限中起重要作用，而且促使缓解期和稳定期气道炎症持续存在。COPD气流受限增加主要在小支气管和细支气管，中性粒细胞这些部位浸润，释放炎症介质、多种蛋白酶，从而诱导气道分泌细胞分泌粘液，引起一系列炎症反应，加重气流受限。同时痰液中中性粒细胞增加而嗜酸性细胞无增加也反映了部分患者对激素治疗的抵抗作用。但有报道[10]一些COPD加重期痰液中嗜酸性粒细胞增加，吸入激素后痰中嗜酸性细胞比例和嗜酸细胞阳离子蛋白降低。因此，定期检测COPD患者诱导痰中细胞分类，嗜酸性细胞比例可估测药物的效果。
本研究进一步证实诱导排痰法的安全性和可行性，共110例COPD患者进行了该项操作，91例患者安全渡过全过程并且痰标本合格。诱导痰液显示了各期COPD患者诱导痰中细胞组成的变化，AECOPD患者诱导痰中的中性粒细胞与肺功能明显相关，从炎症细胞角度说明气道局部炎症在COPD气流受限中的作用，为COPD的抗炎治疗尤其是抗中性粒细胞的治疗提供依据。
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