膳食补充黑米皮对冠心病患者血浆中氧化应激、炎症和脂质水平的影响
作者：王庆， 韩平华，张名位，聂如琼 袁沃亮， 胡艳， 凌文华
【摘要】 【目的】 给予冠心病患者日常膳食中补充黑米米皮，评价其是否可以增强患者体内的抗氧化能力并降低其炎症及血脂水平。【方法】 在中山大学附属第二心血管内科选取60例年龄为45～75岁的冠心病患者，采用随机对照原则将患者分入2组, 30例在常规的基础上每日膳食额外补充10 g黑米米皮为干预组, 余30例在常规治疗的基础上每日膳食额外补充10 g白米米皮为对照组。此外，分别从干预组及对照组中选取3名志愿者，在受试者进食前和进食后0.5、1、1.5、2、4 h采肘静脉血10 mL，通过HPLC法检测患者血浆中的花色苷水平。【结果】 经6个月的干预试验后，干预组患者血浆总抗氧化能力升高了(1.3 ± 3.0)kU/L，而对照组则降低了(0.6 ± 1.7)kU/L，两组间患者总抗氧化能力水平的变化值具有统计学差异(P< 0.05)；干预组患者治疗后血浆可溶性血管细胞粘附因子、可溶性CD40配体和高敏-C反应蛋白分别从（1.4 ± 0.8）g/L、（8.4 ± 4.1）mg/L 和（3.8 ± 1.8）mg/L 降至（1.0 ± 0.5）g/L、（5.7 ± 2.4）mg/L 和（2.6 ± 1.7）mg/L，与对照组相比较均具有统计学差异(P< 0.05)；而两组患者间的血脂、超氧化物歧化酶活性水平的治疗效果无统计学差异。此外，只有在服用了黑米米皮患者血浆中能检测到花色苷（矢车菊素-3-葡萄糖苷），其在血浆中的最高浓度为（20.2 ± 3.0）mg/L出现在1.5 h，而服用白米米皮的患者血浆中在所有的时间段都未检测到任何的花色苷产物。【结论】 膳食补充黑米皮可以作为药物治疗的一种辅助和补充从而增强冠心病患者血浆中的抗氧化能力并改善部分与心血管疾病相关的危险因素，黑米皮对于冠心病患者的保护作用可能与其富含具有抗氧化和抗炎特性的花色苷类物质有关。
【关键词】 黑米皮; 花色苷; 冠心病; 抗氧化; 炎症
动脉粥样硬化(atherosclerosis, As)的发病机理十分复杂，但氧化应激、炎症及血脂水平的升高已被大多数学者证实为As形成的主要危险因素，而且斑块的形成与饮食因素、生活习惯密切相关, 其中饮食习惯和饮食结构的改善对于降低As发生具有重要意义。黑米是稻米中的珍品，因花色苷在果皮和种皮内沉积而成。黑米中蛋白质含量相当丰富，必需氨基酸种类齐全，含有多种微量元素和维生素，此外还含有大量的植物化学物质（phytochemicals），以花色苷类物质为主，包括矢车菊素-3-葡萄糖苷（cyanidin 3-glucoside, Cy-3-g）和芍药素-3-葡萄糖苷(peonidin 3-glucoside, Pn-3-g)。现有的国内外研究报道[1-4]发现,无论体外实验还是动物实验均显示黑米具有较强的抗氧化、抗炎及改善血脂的作用,其活性成分却主要集中在米皮层,我们推测这些作用与黑米中的膳食纤维、维生素和矿物质等因素无关,可能是其米皮层的花色苷类化学物发挥作用[5，6]，但膳食补充富含花色苷的黑米皮是否能对人群AS相关危险因素产生影响则尚未见报道。因此，本实验旨在观察膳食补充黑米皮后，冠心病患者血浆中抗氧化、炎症、脂质及花色苷水平的变化。
1 材料与方法
1.1 临床资料
选取2004年3月至2004年12月期间中山大学附属第二医院心血管专科门诊及病房的60例冠心病患者为研究对象, 均符合WHO诊断标准，部分经冠状动脉造影证实, 不包括①研究开始前3个月内有心肌梗死史或确诊的不稳定型心绞痛史，进行过外科手术的患者；②有肾衰、严重肝脏疾病以及癌症的患者；③有长期服用抗氧化剂（如维生素片）史的患者。
1.2 方法
1.2.1 干预方法 本研究采用随机、单盲、安慰剂对照的方法。60例患者按1 ∶ 1的比例随机（随机数字表）分成干预组和对照组，每组30人。干预组患者在常规治疗的基础上每日膳食额外补充黑米皮产品, 10 g黑米皮加开水300 mL溶解,每日早餐后服用, 6个月为1疗程。对照组患者在常规治疗的基础上每日膳食额外补充10 g白米皮作为安慰剂。
1.2.2 血浆中生化指标的检测方法 黑米皮干预组及对照组患者于治疗前及疗程结束后清晨空腹各抽血1次，采用EDTA抗凝剂抗凝，3 000 r/min 离心后取血浆，测定患者血浆中总抗氧化能力(total antioxidant capacity, TAC)，超氧化物歧化酶(superoxide dismutase, SOD)活性水平,可溶性血管细胞粘附因子(soluble vascular cell adhesion molecule-1, sVCAM-1), 可溶性CD40配体(soluble CD40 ligand, sCD40L), 高敏-C反应蛋白（high sensitive- C reactive protein,hs-CRP）及血脂[包括总胆固醇（total cholesterol, TC）、甘油三脂（triglyceride, TG）、低密度脂蛋白胆固醇（low density lipoprotein cholesterol， LDL-C）、高密度脂蛋白胆固醇（high density lipoprotein cholesterol,HDL-C）。血浆中TAC采用三价铁还原法测定，血浆中SOD活性采用黄嘌呤氧化酶法检测，试剂盒购自南京建成生物研究所。sVCAM-1，sCD40L采用酶联免疫吸附法（ELISA）检测，试剂盒购自比利时Biosource公司和奥地利Bender MedSystems公司。hs-CRP采用免疫比浊法检测，TG采用比色法检测,TC和HDL-C采用酶法检测, LDL-C采用直接法检测，日立全自动生化分析仪测定。
1.2.3 血浆中花色苷水平的检测 在病人中选取了6名志愿者，分为黑米皮服用组（2男1女，49 ± 6 岁）和白米皮服用组（2男1女，48 ± 4 岁）。受试者在实验前2 d和实验当天清晨避免进食富含花色苷的食物，实验前2周避免服用抗炎药物、抗氧化剂和含中药成分的补充剂。在空腹禁食（12～14 h）后，分别将10 g的黑米米皮（约含231 mg花色苷）和10 g白米米皮融于300 mL开水中服下。受试者在进食前和进食后0.5、1、1.5、2、4 h采肘静脉血10 mL（EDTA-K2抗凝），血液样品 4 ℃，3 000 r/min下离心10 min用于分离血浆；血浆标本用容量1/40体积的6 mmol/L HCl酸化后，均置于－80 ℃冰箱保存待用。血浆中的花色苷利用SPE－C18过滤筒（Supelclean ENVI-18，6 mL，0.5 g容量），通过固相萃取的方法浓缩提取。这种过滤筒先用含有10 mL/L盐酸的甲醇10 mL冲洗后，在加入样品前，用10 mL的10 mmol/L草酸浸泡。用注射器取4 mL血浆装入过滤筒中；过滤筒中的样品分别用10 mmol/L草酸，10 mL的二氯甲烷，10 mL的苯缓慢冲洗处理（1滴/s），分别除去样品中的水融性物质，极性脂肪和中性脂肪。最后，将过滤筒中的花色苷用5 mL盐酸甲醇10 mL/L缓慢冲出（1滴/s）。盐酸甲醇溶液用N2吹干后，再重新用200 μL的10 mL/L盐酸甲醇重悬定容，取其中100 μL重悬液用于高效液相色谱法(high performance liquid chromatography,HPLC)检测。流动相选择：40 mL/L的磷酸/乙腈（体积比8.8 ∶ 1.2, pH=2.0）；流速为0.8 mL/min；柱温：30 ℃；检测波长：520 nm。Cy-3-g和Pn-3-g标准品购自挪威polyphenol AS 公司,外标法定量。
1.2.4 统计学方法 连续变量用 ｘ±ｓ表示。计数资料两组比较用 χ2 检验，其他计量资料两组比较用成组 t 检验，而非正态分布的两组患者治疗前后血浆中抗氧化能力、炎性因子及脂质水平变化值的比较用Mann-Whiney U秩和检验。检验水准α取0.05。统计分析用SPSS 11.5版本软件。
2 结 果
2.1 两组患者基本临床资料的比较
黑米皮干预组30例,其中男19例, 女11例, 年龄平均为 64（S = 9)岁, 身体质量指数(Body mass index, BMI)为 (24.0 ± 3.6) kg/m2,其中合并陈旧性脑梗死6例, 陈旧性心肌梗死5例, 高血压病15例,高脂血症16例,糖尿病4例; 24例需服用阿司匹林，16例需服用他汀类药物，15例需服用血管紧张素转换酶抑制剂,6例需服用β-受体阻滞剂，7例需服用钙离子拮抗剂。对照组30例, 其中男17例, 女13例， 年龄平均为64（S = 11) 岁，BMI为(23.2 ± 2.8) kg/m2 其中合并陈旧性脑梗死5例, 陈旧性心肌梗死3例, 高血压病14例,高脂血症18例, 糖尿病5例。22例需服用阿司匹林，18例需服用他汀类药物，12例需服用血管紧张素转换酶抑制剂,8例需服用β-受体阻滞剂，8例需服用钙离子拮抗剂。两组患者的性别、年龄、合并症，用药情况均无统计学差异(P >0.05)。在6个月的追踪期内，每个月要求患者回访一次，发放下一阶段受试物和回收剩余补充剂，并通过家庭访问及电话访问的方式了解受试物的服用情况。根据患者每次返还的补充剂数量显示黑米皮和白米皮服用率分别为(90.9 ± 2.0)%和(91.4 ± 1.8)%。两组病人在试验过程中均未发生不良反应。
2.2 两组患者前后血浆中抗氧化能力、炎性因子及脂质水平的测定结果
经6个月的干预试验后，干预组患者血浆TAC水平较干预前有所升高，而对照组则比干预前略有降低，两组间干预后的变化值具有统计学差异(P< 0.05)；血浆中游离炎性因子的检测结果表明服用黑米皮能明显的降低患者血浆中sVCAM-1，sCD40L和hs-CRP水平，与对照组相比较均具有统计学差异(P< 0.05)；然而经过6个月的试验干预后，两组患者间的各项血脂水平，SOD活性的治疗效果无统计学差异（表1）。
2.3 血浆中花色苷含量的测定结果
在未服用含花色苷的黑米皮前，受试者血浆样品中未检测到花色苷产物。而在服用了黑米皮0，0.5，1.0，1.5和2.0 h后，受试者血浆中Cy-3-g的浓度分别为（10.0 ± 1.6）mg/L，（13.5 ± 3.2）mg/L，（20.2 ± 3.0）mg/L及（5.7 ± 1.4）mg/L，4 h后受试者血浆中Cy-3-g的浓度已低于HPLC法最低检测限，但所有时间段内的血浆样品均未检测到Pn-3-g。白米皮服用组的受试者血浆样品则在所有的时间段均未检测到任何的花色苷产物。
3 讨 论
3.1 黑米皮花色苷在患者体内的代谢情况
我们之前的研究发现黑米皮中的花色苷以Cy-3-g和Pn-3-g为主，分别占总花色苷含量的81％和19％左右，这两种花色苷类物质具有多种生理功能，包括抗氧化、抗炎以及调节血脂和免疫功能，能有效的防治心血管疾病等慢性疾病，但黑米皮花色苷在冠心病患者体内代谢的研究则尚未见报道。很长一段时间人们都认为花色苷类物质必须在肠道微生物作用下生成水解产物后才能进入体内，而现有的研究[7]表明，花色苷在小肠部位能以原型被吸收而进入血液循环。本研究的实验结果显示，患者口服黑米皮后，花色苷能以糖苷原型吸收并出现在血液中，但表现为低吸收、低代谢的特点，这与其他植物中花色苷类物质的代谢研究结果基本一致[8]。
3.2 膳食补充黑米皮对患者抗氧化能力的影响
人体内存在多种由酶系和非酶系物质组成的抗氧化体系，在阻止氧自由基的损伤中起着重要作用。TAC是对机体总抗氧化能力大小的检测。本研究显示，黑米皮干预组患者治疗后血浆中TAC水平显著高于对照组，但SOD活性的两组差异不大, 表明黑米皮可增强冠心病患者体内的抗氧化能力，而且主要表现为增加了血浆内非酶系抗氧化物质的含量，我们推测这种抗氧化作用可能是由于黑米皮中的花色苷物质以原型的形态被人体吸收后直接发挥其抗氧化作用，或者黑米皮膳食补充后改善的是机体组织内抗氧化酶的活性而非血浆中游离的抗氧化酶的活性。
3.3 补充黑米皮对患者心血管危险因素的影响
慢性心脑血管病的主要发病机理和病理基础是As的形成，而现有研究多支持As是血管内皮损伤后的一种缓慢而复杂的炎症性增生性疾病[9]。循环血清中炎症标志物水平能间接反映As斑块的活动程度，因此，检测sVCAM-1、sCD40L和hs-CRP水平的高低对于冠心病患者可能具有重要的临床意义[10-12]。本次研究显示，经6个月干预治疗后，黑米皮组患者的sVCAM-1、sCD40L和hs-CRP较治疗前有明显的改善，而对照组患者的sVCAM-1、sCD40L和hs-CRP水平无明显的变化。有研究表明[13]，体内VCAM-1、CD40L和hs-CRP含量的增高主要是由体内活性氧自由基生成过多造成的，因此，黑米皮抗炎作用可能主要来自黑米皮中富含的具有抗氧化特性的花色苷类物质。
此外，血脂紊乱尤其是LDL胆固醇升高也与As发生密切相关。但在本次试验中，我们并没有观察到膳食补充黑米皮能有效的降低CHD患者的各种血脂水平，这与我们之前的动物实验结果相悖，这种现象可能与参与本次试验部分患者长期服用他汀类药物而且采取低脂饮食导致其血脂水平在参与试验时已处于相对正常的状况从而掩盖了富含花色苷的黑米皮的降脂作用[14-15]。然而也可能膳食补充此剂量的黑米皮尚未能起到降低人群血脂水平的效果。
综上所述，膳食补充黑米皮可以作为药物治疗的一种辅助和补充而增强冠心病患者血浆中的抗氧化能力并改善部分与心血管疾病相关的危险因素，黑米皮对于冠心病患者的保护作用可能与其富含具有抗氧化和抗炎特性的花色苷类物质有关。
【】
XIA M, HOU M, ZHU H，et al. Anthocyanins induce cholesterol efflux from mouse peritoneal macrophages: the role of the peroxisome proliferator-activated receptor {gamma}-liver X receptor {alpha}-ABCA1 pathway [J]. J Biol Chem, 2005, 280(44): 36792-36801.
XIA M, LING W, ZHU H, et al. Anthocyanin prevents CD40?鄄activated proinflammatory signaling in endothelial cells by regulating cholesterol distribution [J]. Arterioscler Thromb Vasc Biol, 2007, 27(3):519-524.
LING W H, CHENG Q X, MA J, et al. Red and black rice decrease atherosclerotic plaque formation and increase antioxidant status in rabbits [J]. J Nutr, 2001, 131(5):1421-1426.
HU C, ZAWISTOWSKI J, LING W H, et al. Black rice (Oryza sativa L. indica) pigmented fraction suppresses both reactive oxygen species and nitric oxide in chemical and biological model systems [J]. J Agric Food Chem, 2003, 51(18): 5271-5277.
GUO H, LING W, WANG Q, et al. Effect of anthocyanin-rich extract from black rice (Oryza sativa L. indica) on hyperlipidemia and insulin resistance in Fructose-fed rats [J]. Plant Foods Hum Nutr, 2007, 62(1):1-6.
XIA X, LING W, MA J, et al. An anthocyanin-rich extract from black rice enhances atherosclerotic plaque stabilization in apolipoprotein E-deficient mice [J]. J Nutr, 2006, 136(8):2220-2225.
TALAVERA S, FELGINES C, TEXIER O, et al. Anthocyanins are efficiently absorbed from the small intestine in rats [J]. J Nutr, 2004, 134(9):2275-2279.
WU X, CAO G, PRIOR R L. Absorption and metabolism of anthocyanins in elderly women after consumption of elderberry or blueberry [J]. 2002, 132(7): 1865-1871.
LIBBY P, RIDKER P M, MASERI A. Inflammation and atherosclerosis [J]. Circulation, 2002, 105(9):1135-1143.
田 敏,刘安丽,魏玉静,等. 冠心病患者外周血可溶性细胞间黏附分子-1、血管细胞黏附分子-1、CD18及P选择素检测 [J]. 郑州大学学报：医学版, 2005,(5):900-901.
边 昶, 陈 鹏. 可溶性CD40配体与急性冠脉综合征研究进展 [J]. 浙江医学, 2004,(11):873-875.
王 伟, 周小辉, 王 欣, 等. C反应蛋白在不稳定型心绞痛及急性心肌梗塞预后预测中的价值[J]. 中山医科大学学报,2000,21(3):223-225.
LYON C J, LAW R E, HSUEH W A. Minireview: adiposity, inflammation, and atherogenesis [J]. Endocrinology, 2003, 144(6):2195-2200.
CARROLL K K. Review of clinical studies on cholesterol-lowering response to soy protein [J]. J Am Diet Assoc, 1991, 91(7):820-827.
DEWELL A, HOLLENBECK C B, BRUCE B. The effects of soy-derived phytoestrogens on serum lipids and lipoproteins in moderately hypercholesterolemic postmenopausal women[J]. J Clin Endocrinol Metab, 2002, 87(1):118-121.
