生育酚结合蛋白通过磷酸肌醇3激酶途径抑制前列腺癌的生长

                  作者：温星桥，李小娟，罗云，王林，周祥福，蔡育彬，温机灵，高新

【摘要】  【目的】 探讨生育酚结合蛋白(TAP)对前列腺癌细胞的生长调节及其分子机制。【方法】四甲基偶氮唑盐生长试验(MTT)测定细胞增殖情况，体外集落形成试验测定各细胞的致癌能力，高效液相层析法检测细胞内维生素E的浓度，利用基因转染、基因沉默、免疫印迹、Northern blot, RT-PCR、荧光定量PCR、免疫沉淀等方法研究TAP对前列腺细胞生长的作用及机制。【结果】 TAP mRNA水平在前列腺癌细胞 LNCaP、PC-3、DU-145、CWR22R中均较正常前列腺细胞RWPE-1低。TAP 可促进癌细胞保留维生素E并增强其抗前列腺癌增殖的效应。无维生素E作用下，转染TAP可抑制前列腺癌细胞LNCaP、DU-145的生长，第6天细胞数比对照组分别减少35.8％与42.4%；LNCaP细胞克隆形成率下降54.3％（P< 0.05）。利用siRNA在良性前列腺细胞 HPr-1中沉默TAP基因，培养9 d后，细胞数比对照组增加124.3％（P< 0.01）。TAP通过抑制磷酸肌醇PI3激酶信号，而非通过影响细胞周期或雄激素受体信号发挥作用。免疫沉淀实验表明TAP通过抑制PI3K的亚单位p110与p85的相互作用，进而干扰PI3K-Akt信号通路；持续激活Akt的活性可削弱TAP对前列腺癌细胞生长的抑制能力。【结论】 TAP不仅能促进前列腺癌细胞摄取和增强维生素E的抗前列腺癌效应，还可通过非维生素E途径发挥作用，可能是防治前列腺癌的有价值的分子靶点。

【关键词】  生育酚结合蛋白； 前列腺癌； 磷酸肌醇3激酶

前列腺癌的发病除与种族、遗传因素有关外，还与营养及饮食结构等多种因素有关。近来有多项大型多中心临床研究表明维生素E可降低前列腺癌的发病率[1，2]。α-生育酚结合蛋白(α-tocopherol-associated protein, TAP)是新近识别出来的、能与α-生育酚（维生素E的一种活性最强的存在形式）特异性结合的新蛋白，主要表达于肝、脑、前列腺等器官。TAP在前列腺癌发病的作用机制未明。前期研究发现TAP可参与吸收、转运维生素E[3，4]。本研究旨在通过体外实验探讨TAP对前列腺癌生长的作用和分子机制。

    1   材料和方法

    1.1   细胞来源

    LNCaP、PC-3、DU-145和RWPE-1细胞（由转染乳头状病毒HPV18而永生化的正常前列腺外周带的上皮细胞）从美国ATCC（American Type Culture Collection）购买；CWR22R细胞来自Dr. CH Kao(美国Indiana University)；HPr-1细胞（由转染乳头状病毒HPV16 E6/E7而永生化的正常前列腺细胞）来自Dr. YC Wong (University of Hong Kong)。

    1.2   化学试剂

    α、γ-生育酚（α、γ-tocopherol）、Flag-M2抗体购自美国Sigma公司；PI3K p110、phospho-FOXO3a、Akt和actin抗体购自美国Santa Cruz公司；FOXO3a 和 PI3K p85 抗体购自Upstate Biotechnology 公司；抗Ser473抗体购自Cell Signaling Technology 公司。雄激素受体抗体和pCDNA3-cAkt质粒来源如报道[5]。

    1.3   质粒构建

    从前列腺增生细胞的cDNA中分离全长TAP序列, 克隆入pCDNA3-flag载体，用pMSCV/U6（包含有抗puromycin 的标记，来自Dr. P.Silver, Harvard Medical School），构建TAP siRNA寡核苷酸链GCATGTGGAGTTCCGAAAGTTCAAGAGACT TTCGGAACTCCACATGCTTTTTT，克隆入pMSCV/U6质粒的ApaI-EcoRI位点，构建成pMSCV/U6-TAPsiRNA，所有构建产物均通过测序证实。

    1.4   质粒转染

    用脂质体转染法（SuperFect，购自Qiagen公司）或者电转染法。电转染 (机器购自Bio-Rad公司)，用悬浮在体积分数2.5% FBS (不含抗生素)的对数生长期细胞，浓度为107个细胞/mL，参数设置：电压280 mV，电容 950 μF，样本容积400 μL，每次转染DNA总量10 μg。

    1.5   细胞培养

    LNCaP、PC-3和CWR22R细胞以含体积分数10%胎牛血清（fetal bovine serum, FBS）的RPMI 1640液（美国Gibco公司）培养[4]，DU-145细胞以含体积分数10%FBS的DMEM液培养。RWPE-1和HPr-1细胞（两者虽均为前列腺上皮细胞株，但内源性TAP含量不一样）用KSF液(Life Technologies公司)培养。

    1.6   细胞生长曲线及集落形成能力

    四甲基偶氮唑盐[3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyltetrazolium bromide, MTT] 法测定生长曲线, 取转染TAP的对数生长期细胞, 3×104 个/孔, 接种于12 孔培养板, 平行接种3 孔转染空载体的细胞作对照。第0、2、4、6天 测定，绘出曲线图。集落形成测定：在6孔培养皿上,每孔加入5 000个细胞, 一式3份, 用新鲜培养液培养, 每4 d更换一次；15 d后, 甲醇固定, 用1%龙胆紫染色后进行集落计数。

    1.7   维生素E浓度测定

    细胞裂解后以0.3 mL 1% 抗坏血酸加0.1 mol/L 硫代硫酸钠溶解。维生素E组份以0.8 mL 己烷提取。于氮气下风干，残留成份以2.5％ 抗坏血酸及甲醇溶解，并用高效液相层析法分析检测，以彩色荧光探测仪 (美国Waters公司) 及相应软件分析结果。

    1.8   免疫印迹（Western blot）

    50 μg的蛋白以SDS-PAGE凝胶电泳后电转移至硝酸纤维膜上[6]。室温下封闭1 h（封闭液为含有0.1% Tween 20 和10%血清的PBS液）后，加一抗室温下孵育1 h，漂洗后加入碱性磷酸酶标记的二抗，室温下反应1 h，充分漂洗后，用碱性磷酸酶反应物(Bio-Rad公司)显色。

    1.9   Northern blot

    用Trizol液(Life Technologies公司) 提取细胞总RNA。15 μg总RNA以10 g/L琼脂糖甲醛凝胶电泳，电转移至Hybond-N+膜（Amersham Pharmacia公司）上。TAP cDNA用[α-32P]dCTP标记（Random Labeling试剂盒， Amersham Pharmacia），用Rapid-Hyb 反应液（Amersham Pharmacia公司）将膜进行杂交，表达信号用放射显影仪分析检测。

    1.10   免疫沉淀分析

    4 ℃下用500 μg 细胞裂解液与抗p110或p85抗体，连续震荡孵育2 h，将25 μL A/G蛋白珠加入每管中，连续震荡孵育2 h。用PBS缓冲液冲洗4遍，收集 A/G蛋白珠重新悬浮在蛋白上样液中，煮沸5 min，凝胶电泳后以Western blot 检测。

    1.11   半定量和实时定量PCR

    用Superscript Ⅱ 试剂盒 (美国Invitrogen公司) 逆转录。引物为: TAP, 5′-CCAGGCAGAAGG AGGCATTG-3′ 和5′-TCGGAG CCAAC GCAGG AG-3′；TTP, 5′-TCAGCGGAATG GAATCAAGG-3′和 5′-ATCCGTAAG TACAGCAGCAATC -3′;细胞视黄醇结合蛋白(CRALBP): 5′-CACGCTGCCCAA GTATGATG-3′ 和5′-CCAGGACAGTTGAGG AGAGG -3′；18S rRNA,5′-TGCCTTCCTTGGATGT GGTAG -3′ 和5V-CGTCT GCCCTATCAACTTT CG-3′。 实时定量PCR按照SYBR Green PCR Master Mix (Bio-Rad) 说明书进行，反应条件：94 ℃变性 3 min，94 ℃下30 s , 60 ℃退火30 s，然后72 ℃下延伸30 s，共40个循环，用iCycler iQ 实时PCR检测系统 (Bio-Rad)，每份标本重复3次而得。

    1.12   统计学处理

    用SPSS 14.0统计软件进行处理。两组间均数的比较用t检验，率的比较用χ2 检验，多组间比较用单因素方差分析。

    2   结   果

    2.1   TAP在前列腺癌细胞表达下调 

    Northern blotting 检测TAP mRNA 在恶性前列腺细胞中的表达比良性细胞明显下降（图1A）；real-time PCR发现与正常前列腺细胞RWPE-1比较，LNCaP, PC-3和CWR22R内的TAP mRNA 表达明显下调（real-time PCR以RWPE-1内的TAP水平设定为1，其余细胞内TAP量以iCycler iQ 软件算出相对值，图1B）。

    2．2   TAP可促进前列腺细胞摄取维生素E

    用 pCDNA3-flag-TAP质粒转染 LNCaP细胞，以G418 选择性培养后获得几个稳定表达的细胞克隆(LN-TAP5, 7, 9, 和10)，以flag抗体行Western blot 表明细胞内有较强的TAP蛋白表达（图2）。向稳定表达TAP的细胞加入20 μmol/L α、γ-生育酚和维生素E琥珀酸盐(vitamin E succinate, VES) 处理12 d，细胞内VitE含量较对照组增加62.5％、73.2％、48.5％。

    2.3   过表达TAP可抑制前列腺癌的生长及增强维生素E的抗增殖作用

    克隆形成实验提示转染TAP后，LNCaP细胞克隆形成数较对照组平均减少54.3%（P< 0.01）。向激素依赖性前列腺癌细胞LNCaP外源性表达TAP后第2、4、6天可见到细胞减少15.2％、26.5%、35.8％（P< 0.01；图3A）。向LNCaP细胞转染TAP，再加入 20 μmol/L VES处理，第2，4，6天可见到细胞比对照组减少34.8％、52.7%、81.9％（P< 0.01）,抑制程度明显大于无转染TAP的情况。 向激素非依赖性前列腺癌细胞DU-145转染TAP，第2，4，6天可见到细胞减少17.5％、29.3%、42.4％（P< 0.01）。如图3B，利用RNA干扰技术下调正常前列腺细胞HPr-1内源性TAP的表达，培养9 d后，MTT测定表明转染下调TAP后，细胞数比对照组增加124.3％（P< 0.01）。

    2.4   TAP调节 PI-3K-Akt 信号途径

    Western blot检测细胞内雄激素受体（androgen receptor, AR）的表达，转染TAP组和对照组AR表达水平没有差异（图4A）。稳定表达TAP的LNCaP细胞克隆 (LN-TAP5, 7, 9)、对照细胞 LN-V1 和母系 LNCaP 行Western blot 检测表明TAP 表达与 Akt磷酸化程度呈负相关，富含TAP的细胞内部Akt蛋白的磷酸化程度很低。

    稳定表达TAP的LNCaP细胞与对照细胞 LN-V1的裂解液与抗p110或p85抗体分别共孵育行免疫沉淀，如图4B，Western blot 检测提示TAP 干扰 p110 与 p85二聚复合体的形成。向LN-TAP5 细胞内转染持续激活的Akt，同时转染GFP以检测转染效率。如图4C，Western blot检测细胞内有Akt表达，MTT结果表明激活Akt可削弱TAP对前列腺癌细胞的抑制作用。电转染法转染TAP后可减少LNCaP细胞内Akt磷酸化程度，加入α－生育酚并不能进一步加强TAP对Akt磷酸化的抑制（图4D）。

    3   讨   论

    本研究发现TAP在多种前列腺癌细胞如LNCaP、DU-145、CWR22R的表达比正常前列腺细胞RWPE-1的表达水平明显下降，与我们前期应用原位杂交和免疫组化测定TAP在前列腺癌的表达比在良性前列腺增生明显减弱的发现相吻合[7]。在前期研究中，我们已经发现TAP阴性的前列腺癌患者手术前PSA水平、Gleason评分均高于TAP阳性患者，术后出现临床复发时间（32.5±6.2）个月小于TAP阳性患者（78.5±12.6）个月，表明TAP与前列腺癌的恶性程度存在负相关关系[7]。

    探索维生素E在前列腺细胞内的转运及作用机制对防治前列腺癌有重要意义，已知维生素E可作用于前列腺癌细胞周期并抑制其增殖[8]，Thompson 等[9]发现维生素E的色原烷醇部分PMCol具有抗雄激素活性。为评价硒和α-生育酚对前列腺癌的预防作用，美国国立癌症研究院2001年专门开展了一项共32 400例参与者的、长达12年的大型前瞻性研究（SELECT）[2,10]。本研究为进一步阐明TAP在前列腺癌的发病机制提供了良好的实验基础，发现TAP可促进前列腺癌细胞对维生素E的摄取、保留能力，TAP与α-生育酚有很高的亲和能力，表明维生素E抑制前列腺癌的作用受TAP的调节，临床上应用维生素E防治前列腺癌时，如果配合增强TAP信号在前列腺细胞的表达，可望发挥更好的效果。

    迄今为止TAP在前列腺的作用机制未明，PI3激酶（phosphoinositide 3-kinase，PI3K）/Akt信号是前列腺癌细胞的重要生存信号途径。我们发现TAP可干扰P110α-P85复合体的形成，下调Akt的磷酸化程度。PI3K是由催化亚单位p110和调节亚单位p85所组成的二聚体蛋白, 具有类脂激酶和蛋白激酶的双重活性，TAP抑制该两亚基的相互结合、可降低PI3K的活性，影响PI3K及其下游分子丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶Akt所组成的信号通路，可能在前列腺癌的发病与肿瘤进展中起重要作用。TAP还可抑制Akt下游信号FOXO3a的磷酸化，与Kempna等[11]发现TAP在白血病细胞中可下调PI3K/P110γ活性的发现相吻合。Yamauchi[12]发现TAP可进入细胞核参与核内信号转导，但其调控效应未明。雄激素受体在前列腺癌细胞的增殖和生存能力中起重要作用，我们检测转染TAP的LNCaP细胞内AR的表达水平，发现AR表达并不受TAP干扰。进一步研究TAP参与前列腺细胞的信号转导机制，将有利于阐明TAP抗前列腺癌的机理及更好地利用维生素E防治前列腺癌。抑癌基因的突变或者不正常表达是肿瘤发生的重要原因，如Ras相关域家族因子[13]，前髓细胞白血病基因[14]等, 本研究结果提示TAP可能与以上基因有类似之处，在前列腺癌的发病中扮演抑癌基因的角色。

    总之，TAP是首个被发现具有抑制前列腺癌增殖作用的维生素E结合蛋白，不仅能促进前列腺癌细胞摄取维生素E、还可通过非维生素E途径抗前列腺癌，TAP可能是防治前列腺癌的有价值的分子靶点。

    (感谢：美国罗彻斯特大学泌尿外科Messing E.教授等对本实验的指导和帮助)

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