部分喉切除术后喉狭窄瘢痕组织中TGF-β1和α-SMA的表达
作者：吴旋， 苏振忠， 蒋爱云 赖英荣， 雷文斌
【摘要】 【目的】 研究喉狭窄瘢痕组织的病理变化, 了解转化生长因子β1（TGF-β1）和?琢-平滑肌肌动蛋白（α-SMA）在喉狭窄瘢痕组织中表达及意义。【方法】 垂直喉部分切除术后2～3个月出现喉狭窄10例和未狭窄16例喉瘢痕肉芽组织为实验组及10例正常声带组织为对照组，进行免疫组化染色，观察组织切片中TGF-β1和α-SMA的表达，并在KONTRON IBAS 2.5全自动图像分析系统下进行阳性细胞计数。【结果】 TGF-β1阳性表达主要分布于炎症细胞及成纤维细胞的胞浆，α-SMA阳性表达的主要分布于肌成纤维细胞胞浆。比较非狭窄喉瘢痕组织及正常声带组织，喉狭窄瘢痕组织的TGF-β1和α-SMA的表达均明显增强，阳性细胞数量差异有统计学意义（P< 0.05）。【结论】 喉狭窄瘢痕组织的TGFβ1及α-SMA高表达，这些改变可能是喉狭窄发生重要内在因素。
【关键词】 垂直喉部分切除； 喉狭窄； 瘢痕/病； 转化生长因子β； 平滑肌动蛋白
手术创伤引起喉内瘢痕过度增生，导致喉狭窄是喉外科手术常见的并发症，虽然发病率不高，但临床处理较困难。对其发生原因，临床上大多数学者认为与喉支架大块缺损、喉腔组织大范围损伤而又修复不良有关。但从喉瘢痕组织形成的病理学角度去探索形成瘢痕的机理，从而明确产生喉瘢痕狭窄个体差异原因的研究不多[1，2]。喉部分切除术后瘢痕性喉狭窄的病理方面研究，国内外有关此方面报道也较少[3]。本文从瘢痕组织形成的病理学角度去探索喉狭窄形成瘢痕的机理，初步探索与创伤愈合和瘢痕形成密切相关的转化生长因子β1（transforming growth factor β1，TGF-β1）和平滑肌动蛋白α（α-smooth muscle actin，α-SMA）在喉切除术后瘢痕性喉狭窄的发病过程中作用。
1 材料与方法
1.1 临床资料
1.1.1 病例入选标准 ①非狭窄组: 声门型喉癌T2期患者行垂直喉部分切除术，单侧胸骨舌骨肌瓣重建喉腔; 术后均成功拔管；随访期间未出现喉狭窄。②喉狭窄组:声门型喉癌T2期患者行垂直喉部分切除术，单侧胸骨舌骨肌瓣重建喉腔; 术后早期能成功拔管，术后2～3个月时出现进行性呼吸困难，需重新行气管切开，喉狭窄组织病理活检已排除复发。内镜和影像学发现喉腔瘢痕肉芽堵塞，喉腔狭窄。③正常对照组：10例双声带麻痹行声带切除患者。
1.1.2 临床及病理特征 ①非狭窄组：中山大学附属第一耳鼻咽喉科医院2003年4月～2005年4月间收治的16例符合入选标准的喉部分切除术患者，所有患者均为首次手术，术前术后未做过放疗和化疗，无远处转移，年龄46～71岁，平均年龄59岁，病理类型：高分化鳞癌11例，中分化鳞癌5例。按照UICC1997年TNM分类和分期法对本组病例进行分期，T2N0M0 13例，T2N1M0 3例。随访时间为6月～12月，平均10月。②狭窄组：收集中山大学附属第一医院耳鼻咽喉科医院1994年1月～2005年6月期间收治的的喉部分切除术后喉狭窄患者26例,其中符合入选标准10例，入选病例术前术后均未做过放疗、化疗、无远处转移，年龄42～69岁，平均年龄56岁。病理类型：高分化鳞癌7例，中分化鳞癌3例，按照UICC1997年TNM分类和分期对10例进行分期，T2N0M0 8例，T2N1M0 2例。③正常对照组：2003年4月～2005年4月收治甲状腺手术误伤喉返神经麻痹致呼吸困难，须行声带切除术者。
1.2 标本提取及保存
①正常对照组：取自双声带麻痹行声带切除术的10例组织蜡块；②非狭窄组：喉部分切除术后2～3个月，喉镜下钳取喉腔创面瘢痕肉芽组织（创面边缘、中央2-3处钳取）， 经40 g/L多聚甲醛固定，石蜡包埋，储存备用；③狭窄组：喉部分切除术后2～3个月出现瘢痕性喉狭窄，支撑喉镜或电子喉镜送检的瘢痕肉芽组织，经40 g/L多聚甲醛固定，石蜡包埋，储存备用。
1.3 免疫组化检测组织中TGF-β1、α-SMA表达
①试剂：一抗试剂购自福建迈新生物公司。TGF-β1, 兔抗人多克隆抗体，编号RAB-0238。α-SMA 鼠抗人单克隆抗体，编号MAB-0003。②SP法免疫组化检测试剂盒，产品编号KIT-9710，购于福建迈新生物公司。③SP免疫组化方法：组织石蜡切片，厚5 μm, 60 ℃恒温箱内烤片1 h。二甲苯脱蜡和水化，酒精梯度脱二甲苯，蒸馏水清洗。抗原修复：作α-SMA免疫染色的切片用高温高压修复法处理。作TGF-β1免疫染色的切片不作特别处理，置于30 mL/L H2O2溶液中室温下孵育30 min，以去除内源性过氧化物酶活性。PBS液洗。滴加正常山羊血清，37 ℃孵育10 min。滴加一抗，4 ℃过夜，PBS清洗。滴加二抗（生物素化羊抗鼠抗体），37 ℃孵育20 min， PBS清洗。加链霉菌生物素-过氧化物酶溶液，37 ℃孵育20 min，PBS清洗。DAB显色剂显色，苏木素复染，片烤干，封片，光镜下观察。
1.4 免疫组化检测结果的观察及判断
细胞计数：取α-SMA免疫组化染色的组织切片，每张切片固有层随机取8幅视野，采用全自动图像分析仪对阳性细胞进行计数，在400倍显微镜下记录每屏幕（10814 μm2）中的阳性细胞数。同样方法于TGF-β1免疫组化染色的组织切片，切片分别取上皮层和固有层各4幅视野进行计数。
阴性对照由ＰＢＳ替代一抗,并由已证实的阳性片作对照。连续观察切片中8个高倍视野(×400),以细胞浆呈弥漫棕黄色细小颗粒为阳性细胞,计数总细胞数及其中阳性细胞数,以阳性细胞百分比表示。染色强度分为三级:-，～5%；±，50%；+，~75%； ++， ＞75 %。
1.5 统计学处理
计量数据用ｘ±ｓ表示；多个样本均数比较采用ANOVA和SNK-q检验，取?琢=0.05，统计在SPSS11.0软件下完成。
2 结 果
2.1 TGF-β1在喉狭窄组织中表达情况
TGFβ1阳性细胞胞浆、胞膜中有黄色至棕黄色颗粒。TGFβ1阳性表达的黄色颗粒主要分布于炎症细胞及成纤维细胞的胞浆。正常对照组中TGF-β1弱阳性表达。非狭窄组中可见上皮细胞、炎症细胞、成纤维细胞和血管内皮细胞胞浆、胞膜黄色染色，呈阳性表达(图1A)。喉狭窄组中可见较多的阳性细胞，细胞胞浆棕黄染色，上皮细胞、炎症细胞、成纤维细胞均染色(图1B)。细胞计数及比较见表1。
2.2 ?琢-SMA在喉狭窄组织中的表达
α-SMA阳性表达见于血管壁平滑肌和肌成纤维细胞，阳性细胞表现为胞浆、胞膜中有黄色至棕黄色颗粒。正常对照组中α-SMA弱阳性表达。非狭窄组中固有层可见少数阳性表达肌成纤维细胞，胞浆、胞膜呈黄染(图2A)。喉狭窄组中固有层可见较多的胞浆、胞膜棕黄染色阳性细胞，分布密集(图2B)。细胞计数及比较见表1。
3 讨 论
3．1 TGF-β1在喉狭窄瘢痕组织表达意义
TGF-β1是指调节细胞增殖，分化细胞间质的一类多功能细胞生长因子，是目前已知与瘢痕形成关系是最密切，最有代表性的生长因子，可由多种细胞合成。TGF-β1可促进细胞外基质（ECM）效应细胞增殖和聚集，并可直接刺激其产生大量的胶原(尤其是Ⅰ型胶原纤维)、纤维粘连蛋白（Fn）、基质粘多糖蛋白，并抑制ECM的降解等。
Dillard [4]研究TGF-β1在鼠喉组织表达，发现在正常喉组织中有TGF-β1表达，喉裂开创伤后，术后早期1、2 d，喉腔创面组织TGF-β1表达明显增强，术后21 d，TGF-β1表达恢复正常水平。另外，Dillard应用外源性TGF-β1和TGF-β1中和抗体喉创伤，结果发现外源性TGF-β1导致喉创伤组织炎症反应和纤维化反应明显增强，术后1、7 d喉组织纤维粘连蛋白及Ⅰ型前胶原蛋白呈过度表达趋势，喉腔创面明显狭窄。而应用TGF-β1中和抗体，喉创伤组织炎症反应明显减弱，纤维粘连蛋白，Ⅰ型前胶原表达减弱, 因此认为喉创伤后喉组织TGF-β1过度表达可能导致喉狭窄。
本研究中，免疫组化结果提示，喉部分切除术后2～3个月，非狭窄喉瘢痕组织中，TGF-β1仍有阳性表达，TGF-β1阳性细胞数多于正常对照组。喉狭窄瘢痕组织中，TGF-β1表达显著强于非狭窄喉瘢痕组织。喉狭窄瘢痕肉芽组织中TGF-β1呈高水平表达，这与既往有关喉狭窄报道相一致。
3．2 α-SMA在喉狭窄瘢痕组织表达意义
α-SMA是组织中肌成纤维细胞最常见的标志，可用α-SMA鉴定肌成纤维细胞[5]。肌成纤维细胞是由成纤维细胞分化而来的细胞，具有收缩并有活跃的分泌功能，它参与创面的收缩及组织纤维化过程。Germain等[6]研究发现，来源于肉芽组织的成纤维细胞，其α-平滑肌肌动蛋白的表达量明显高于真皮组织中的成纤维细胞，而且前者的收缩性也明显高于后者。正常情况下, 肌成纤维细胞通过细胞凋亡而消失, 而在增生性瘢痕和纤维化性疾病中持续存在[7]，其机理可能与TGF-β1持续高表达及其他某些细胞生长因子的直接或间接作用有关。
本研究中，免疫组化结果提示，喉部分切除术后2～3个月，非狭窄喉瘢痕组织中，肌成纤维细胞数明显多于正常对照组。与非狭窄喉瘢痕组织相比，喉狭窄瘢痕组织中肌成纤维细胞数增多，差异有显著意义。喉狭窄瘢痕组织中肌成纤维细胞数过度增多，其原因可能有多种途径：成纤维细胞对高表达TGF-β1的敏感性增加；高表达TGF-β1通过促使成纤维细胞表型向肌成纤维细胞表型转化，同时通过阻止肌成纤维细胞的凋亡[8]，致使喉狭窄瘢痕组织中肌成纤维细胞数量明显增多。
我们以前的研究结果[3]提示，与非狭窄喉瘢痕组织、正常对照组相比，喉狭窄瘢痕组织中胶原纤维量明显增多，而且主要是I型胶原纤维增多。喉狭窄瘢痕组织中胶原纤维量过度增多，可能原因有如下：高表达TGF-β1可刺激胶原基因和Fn基因的启动子，使转录增加，从而造成胶原合成增加[9]。高表达TGF-β1刺激成纤维细胞中葡萄糖与氨基酸的转运和糖酵解的进行，导致细胞外基质合成显著增加[10]。高表达TGF-β1明显剌激Ⅰ型胶原纤维的合成, 并通过胶原酶选择性地损伤存在于瘢痕组织中的Ⅲ型胶原纤维，使Ⅰ/Ⅲ型胶原比率上升[11]。
我们以前的研究结果[12]提示，喉狭窄瘢痕肉芽组织中存在明显炎症反应，持续炎症反应可能是导致喉狭窄瘢痕肉芽增生重要因素之一。本研究中，喉狭窄瘢痕组织中TGF-β1高表达的原因尚不十分清楚，可能与呼吸道感染刺激作用引起的创面慢性炎症有关。设法减少呼吸道感染刺激引起炎症反应的量和程度，可能有助于预防和减轻术后喉瘢痕肉芽增生和管腔狭窄。
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