急性甲醇中毒大鼠模型及其眼部改变的实验研究

                作者：佘洁婷， 张少冲， 程建新， 冷云霞    

【摘要】  【目的】 探讨急性甲醇中毒大鼠模型的制作方法及其眼部改变，为研究中毒后视功能损害及救治方法建立基础。【方法】 SD大鼠32只，随机分为A（低剂量甲醇组）、B（高剂量甲醇组）、C（生理盐水对照组）、D（空气对照组）四组，每组8只。A、B组吸入N2O/O2混合气及不同剂量甲醇灌胃，C组吸入N2O/O2混合气及生理盐水灌胃，D组置于正常空气中并按B组剂量给予甲醇灌胃，观察各组大鼠一般情况、体质量及眼部改变、静脉血甲醇浓度、视网膜电图和视网膜组织学改变。【结果】 染毒大鼠反应迟钝、运动失调，视盘充血水肿、视网膜点状出血，A组大鼠体质量为(187±12) g，B组为(176±13) g，较C、D对照组显著减轻（P< 0.05）；A组视网膜电图a、b波振幅分别为(87±13) μV、(187±38) μV，B组a、b波振幅分别为(53±19) μV、(132±39) μV，与对照组相比明显下降（P< 0.05）；视网膜在光镜下表现为各层细胞水肿、排列紊乱及空泡化；电镜下细胞凋亡，线粒体肿胀、嵴断裂；B组动物上述改变尤其明显。【结论】 吸入N2O/O2混合气及甲醇灌胃可建立急性甲醇中毒的大鼠模型，出现典型的视网膜结构和功能改变。

【关键词】  甲醇； 急性中毒； 大鼠模型； 灌胃

     Abstract: 【Objective】 To develop a rat model manifesting acute methanol poisoning and study the ocular changes so as to lay foundations for further investigation of visual impairment caused by methanol intoxication and its treatment.【Methods】 Thirty-two SD rats were randomly divided into group A (low methanol dosage group, n=8), B (high methanol dosage group, n=8), C (saline control group, n=8) and D (air control group, n=8). Group A and B were exposed to a mixture of N2O/O2 and given different dosage of methanol by gavage. Group C was exposed to N2O/O2 and given the same volume of saline as group B. Group D was exposed to normal air and given the same dosage of methanol as group B. General condition, body mass, and ocular changes, methanol concentration in venous blood, electroretinogram and retinal histopathologic changes were analyzed.【Results】Methanol-intoxicated rats were characteristic by slow reaction, incoordination, optic disc hyperemia and edema and retinal haemorrhage. Body mass loss was significant in group A and B when compared with group C and D (P< 0.05), which were (187±12) g in A and (176±13) g in B, respectively. A-wave and b-wave of electroretinogram were markedly reduced in group A and B (P< 0.05), which was (87±13) μV and (187±38) μV in group A, and (53±19) μV and (132±39) μV in group B, respectively. Retinal edema, derangement of cells and prominent vacuoles were obvious under light microscope. Morphologic changes under electromicroscope were characteristic by cell apoptosis, mitochondria swollen, and cristae disruption. These changes were more obvious in group B.【Conclusion】Acute methanol poisoning in rats could be successfully duplicated by exposure to a mixture of N2O/O2 as well as methanol administration by gavage, with typical retinal structural and functional changes.

    甲醇（methanol, CH3OH）是一种无色、有毒的挥发性液体，可经呼吸道、胃肠道和皮肤吸收进入人体而中毒。近年因饮用假酒致急性甲醇中毒的事件时有发生，随着甲醇在人们生产、生活中应用日益广泛，其意外中毒的可能性不断增加。中毒后幸存者常遗留不同程度的视觉损害，而目前甲醇致视功能损害的机理尚未明确，国内仅见临床病例报道[1]，缺乏相关的实验研究。国外研究采用的大鼠种属在我国并不普及，在建模方法、染毒剂量、评价指标等方面缺乏系统性及可比性[2,3]。本研究采用SD大鼠，设立不同剂量甲醇灌胃组，借鉴人类急性甲醇中毒的诊断标准制订该模型的评价指标，探讨其眼部结构和功能改变，较系统地建立了急性甲醇中毒的大鼠模型，为今后进一步研究视功能损害机理及救治方法打下基础。

    1   材料和方法

    1.1   主要试剂与仪器

    分析纯甲醇（广州化学试剂厂），以生理盐水稀释成质量浓度为30％的甲醇溶液；40 L压缩N2O∶O2混合气体（1∶1，广州气体厂）；4％多聚甲醛、苏木素、伊红（中山眼科中心病理室提供）；2.5％戊二醛、1％四氧化锇（中山大学医学院电镜室提供）；枸橼酸钠抗凝管、生理盐水；NEUROPAKⅡ电生理检查仪（日本光电公司），Stemi 2000-C显微镜（德国ZEISS），H-600透射电镜（日本HITACHI）。

    1.2   实验动物分组及模型建立 

    健康SPF级雄性SD大鼠32只（广东省医学实验动物中心提供，合格证号：粤监证字2005A010），体质量200~220 g，用随机数排序分组法分为4组，每组8只。A组：低剂量甲醇组；B组：高剂量甲醇组；C组：生理盐水对照组；D组：空气对照组。从灌胃前4 h起至实验结束，A、B、C组大鼠均置于一密闭有机玻璃箱中，以2 L/min的速度通入N2O∶O2混合气体，D组大鼠置于正常空气中。开始通气时间定为0 h，分别在第4，24，48 h给各组大鼠灌胃，A组：首次甲醇溶液灌胃剂量为2 g/kg，其后每次1 g/kg；B组：首次灌胃剂量4 g/kg，其后每次2 g/kg；C组：与B组等体积的生理盐水代替甲醇灌胃；D组：按B组剂量给予甲醇溶液灌胃。第60小时停止通气，作各项指标检测。

    1.3   模型的评价指标及方法

    1.3.1   全身及眼部的中毒表现   观察甲醇灌胃后大鼠的反应、活动、意识状态、体质量变化；裂隙灯观察结膜、角膜、前房、晶状体改变；直接眼底镜观察视网膜血管、视盘等的改变。

    1.3.2   视网膜电图检测   于第60天取出大鼠暗适应4 h，复方托品酰胺散瞳，氯胺酮50 mg/kg、氯丙嗪25 mg/kg混合腹腔注射，丁卡因表麻，NeuropackⅡ电生理仪检测视网膜电图（Electroretinogram, ERG），记录I16单次白光刺激下a波、b波潜伏期及振幅。所有操作均在有微弱红光照明的暗室内进行，未检查眼用不透光黑布遮盖避光，角膜电极、电极和地电极分别置于角膜表面、舌下和尾部。

    1.3.3   静脉血甲醇浓度的检测   ERG检查结束后，剪开大鼠胸腔，从右心房抽取静脉血2 mL注入干燥真空的枸橼酸钠抗凝管中充分振荡，采用顶空气相色谱法检测血中甲醇浓度。

    1.3.4   视网膜组织学检查   采血后以断颈法处死大鼠，迅速摘除双眼球，解剖显微镜下去除眼前节，分离视网膜，固定于4％多聚甲醛中48 h，按常规制成石蜡切片，HE染色，光镜下观察。

    1.3.5   视网膜超微结构检查   按上述方法分离视网膜，剪出1 mm×5 mm大小视网膜组织，PBS漂洗，固定于2.5％戊二醛4 ℃冰箱过夜，次日1％四氧化锇后固定2 h，丙酮系列脱水，Epon812定向包埋制成超薄切片，醋酸双氧铀γ柠檬酸铅双染色，透射电镜下观察。

    1.4   统计学分析

    实验数据以均数±标准差表示，采用SAS10.0统计软件的one-way  ANOVA 及SNK-q检验对各组间差异进行分析，以α＝0.05作为检验水准。

    2   结   果

    2.1   中毒表现

    A组大鼠毛色差，活动减少，消瘦；B组中1只大鼠于第2次灌胃后5 h死亡，其余动物毛色灰暗，反应呆滞，明显消瘦，运动失调，结膜及鼻孔出血。裂隙灯下各组动物角膜、前房、虹膜、晶状体未见特殊改变；直接眼底镜下A组动物出现视网膜血管轻度迂曲及点状出血，B组动物视盘边界不清，表面充血，视网膜灰白混浊，有点、片状出血，血管迂曲变细。C、D组动物毛色光滑，反应如常，眼底无异常改变。实验结束时，C、D组体质量无显著性差异；与对照组比较，A、B组体质量下降，差异有统计学意义（F=30.84，P< 0.0001，表1）。

    2.2   视网膜电图

    A组、B组中分别有1只和2只大鼠ERG波形熄灭，其余数据见表2。 A、B组大鼠的a波及b波振幅较对照组明显下降（P< 0.0001）, B组b波潜伏期较其它组别延长（P< 0.05），a波潜伏期无明显改变（P >0.05）。C、D组ERG各成分之间差异无统计学意义（P >0.05）。ERG波形改变见图1。

    2.3   静脉血甲醇浓度

    标准曲线C＝6.8989＋0.008254A（A为峰面积）。相关系数r＝0.9938。A组静脉血甲醇浓度为(43.8±16.5) mmol/L，B组为(219.0±41.0) mmol/L，均显著高于C组(3.4±2.4) mmol/L和D组(14.4±6.2) mmol/L (F=161.42, P<0.0001)；其中B组比A组增高更为明显（P< 0.05）。C、D组甲醇浓度处于较低水平，两组之间差异无统计学意义（P >0.05）。

    2.4   视网膜病理改变

    2.4.1   光镜改变   A组视网膜内、外颗粒层排列紊乱，细胞间隙扩大，神经节细胞层轻度水肿（图2A）；B组视网膜各层水肿，光感受器外节出现空泡，外颗粒层、内颗粒层排列明显紊乱，细胞间隙扩大，神经节细胞层疏松、水肿，空泡明显（图2B）；C组、D组视网膜形态正常，结构清楚，各层细胞排列整齐、紧密（图2C、D）。

    2.4.2   电镜改变   B组内、外颗粒层细胞凋亡普遍，细胞核固缩，细胞器结构不清（图3A）；光感受器膜盘排列紊乱、肿胀并出现空泡（图3B）；内、外节及内、外丛状层线粒体广泛肿胀，部分线粒体嵴断裂、空泡化甚至嵴消失（图3C）。A组改变较B组轻，有细胞凋亡现象但不常见。C、D组大鼠视网膜超微结构正常，细胞排列紧密，染色质疏松、清晰，膜盘排列整齐，线粒体形态正常（图3D、E、F）。

    3   讨   论

    3.1   急性甲醇中毒的临床诊断标准及模型评价指标

    人类急性甲醇中毒主要表现为神经系统和眼部的损害，临床诊断标准依据甲醇摄入史、血液甲醇浓度超标、神经系统及眼部损害的症状和体征如头痛、意识障碍、视物模糊、视野损害、视网膜电图和视觉诱发电位异常等[1,4]。本研究采用灌胃的方式模拟甲醇经口染毒的过程，并借鉴了人类急性甲醇中毒的诊断标准制订出该模型的评价指标，包括中毒后的一般表现、静脉血甲醇浓度、ERG及视网膜病理改变，从功能学和形态学两方面评价甲醇中毒对眼部的影响，结果显示大鼠中毒后上述各项指标与人类中毒后的改变非常接近，表明吸入N2O/O2混合气及甲醇灌胃可复制出典型的急性甲醇中毒大鼠模型。

    3.2   模型建立的关键点

    啮齿类动物由于体内四氢叶酸水平比灵长类高，能辅助10-甲酰四氢叶酸脱氢酶（10-FDH）降解甲醇毒性代谢产物，不容易产生甲醇中毒[5,6]。N2O:O2混合气能抑制大鼠体内四氢叶酸盐合成[7]，使10-FDH缺乏辅助因子而丧失解毒能力，是本模型制作的关键之一。通入N2O∶O2混合气4 h后开始灌胃是为了完全抑制10-FDH的活性，再采用首次剂量加倍、重复两次灌胃的方法，使大鼠体内的甲醇浓度达到一个相对恒定的状态，保证了建模成功。生理盐水对照组（C组）未出现任何异常表现，表明N2O:O2混合气对大鼠的正常生理状态无影响。为评价不同剂量甲醇对大鼠的影响，本实验将动物分为低、高剂量甲醇灌胃组比较，发现高剂量组（B组）中毒表现更为突出，且有动物死亡；低剂量组（A组）各种改变较轻，这种建模方法能较全面地模拟人类不同程度的中毒表现。

    3.3   急性甲醇中毒的眼部损害及其可能机制

    甲醇对眼部损害主要体现在眼底的异常改变。ERG是反映视网膜功能的一项无创、敏感检查，a波代表了视网膜光感受器的电位变化，b波起源于Müller细胞和双极细胞，反映视网膜内颗粒层区域细胞的电活动[8]。本实验结果显示甲醇对光感受器和内颗粒层细胞均有毒性作用，对视网膜视觉信号传导产生了严重影响。视网膜形态学改变表现为视网膜各层组织的水肿、细胞排列紊乱；细胞器的改变以线粒体最为突出，表现为肿胀、嵴断裂甚至消失；细胞凋亡也不少见，上述病理改变在高剂量组尤其显著。有研究[9,10]认为甲醇的毒性代谢产物甲酸可抑制线粒体细胞色素氧化酶的功能，使ATP合成受阻，并消耗大量还原型谷胱甘肽，增加细胞氧化应激，本实验中毒大鼠视网膜的病理改变与此观点相符。视网膜各层尤其是光感受器细胞的生化代谢极为活跃，是全身耗氧量较高的器官之一。线粒体传递及氧化磷酸化受阻，不能为视网膜提供足够的能量供应，必然导致细胞离子泵功能障碍，各层组织以及细胞器的明显水肿。ATP除了是细胞赖以生存的能量分子之外，还可能通过嘌呤受体P2X7介导细胞的凋亡[11]。此外，中毒动物视网膜水肿、血管迂曲变细的眼底改变还可能与局部血管活性物质异常变化有关，眼底血液循环障碍加重了组织缺血缺氧状态，细胞能量耗竭及由此触发的细胞凋亡可能是急性甲醇中毒致视功能损害的重要机制，有待今后进一步深入研究。

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