冬凌草甲素作用PI3K/AKT通路诱导HeLa细胞凋亡
作者：沈宏伟， 胡红珍， 曾海涛， 柯佩琪， 杨越波， 李小毛， 任姿
【摘要】 【目的】研究冬凌草甲素诱导HeLa 细胞凋亡的作用及其机制。【方法】MTT 法测定冬凌草甲素对HeLa 细胞的生长抑制实验, Hoechst 33342荧光染色等观察细胞核形态学变化; LDH 法研究细胞死亡的途径。流式细胞仪检测细胞的凋亡，免疫印迹实验检测相关蛋白的表达。【结果】 25 μmol/L以上的冬凌草甲素对宫颈癌HeLa细胞具有明显的生长抑制作用,并能诱导细胞发生凋亡,随着药物浓度的增加和作用时间的延长,细胞的生长抑制率及细胞凋亡率均明显升高, 冬凌草甲素抑制细胞生长及诱导细胞发生凋亡的过程中,细胞端粒酶Akt、FKHRL、GSK3表达水平及活性显著降低。【结论】 冬凌草甲素能够通过诱导人子宫颈癌HeLa 细胞发生凋亡而发挥抑制HeLa 细胞生长作用，抑制Akt和GSK3的活性是冬凌草甲素体外诱导人子宫颈癌HeLa 细胞发生凋亡的重要作用机制之一。
【关键词】 宫颈癌； 冬凌草甲素； AKT/PKB
Abstract: 【Objective】 The purpose of our study was to investigate the apoptosis-inducing effect and mechanism of action of oridonin, a diterpenoid isolated from Rabdosia rubescens, in human cervical carcinoma HeLa cell line. 【Methods】Morphological analysis, nuclear condensation, and fragmentation of chromatin were monitored using Hoechst 33342 staining. Cell viability was assessed using the MTT colorimetric assay. Cell apoptosis and apoptosis-related proteins in HeLa cell line were evaluated by flow cytometry and Western blot analysis. 【Results】Oridonin suppressed the proliferation of several cervical carcinoma HeLa cell line in a dose- and time-dependent manner. Oridonin treatment dephosphorylated and/or inactivated constitutively active AKT, and glycogen synthase kinase 3 (GSK3). In addition, oridonin treatment of cervical carcinoma HeLa cell line down-regulated the expression of the inhibitor of apoptosis protein. 【Conclusion】 Our results showed oridonin may suppress constitutively activated targets of phosphatidylinositol 3-kinase (AKT and GSK3) in cervical carcinoma HeLa cell line, inhibiting the proliferation and induction of caspase-dependent apoptosis.
Key words: cervical carcinoma; oridonin; AKT/PKB
妇科恶性肿瘤之一[4]。研究表明它具有抑制HeLa 或HL260 细胞生长的作用[5,6],但对其抑制HeLa 生长的作用机制目前尚不明。信号转导通路的异常改变是肿瘤细胞的重要生物学特性,其中磷脂酰肌醇-3激酶(phosphatidylinositol-3-kinases, PI3K) 在肿瘤信号转导中起着重要的调节作用。细胞在一系列内外因素的作用下,通过启动PI3K/Akt 信号转导通路,诱导细胞的增殖、分化,避免细胞发生凋亡，在维持细胞恶性生物学特性中起重要作用。在肿瘤细胞逃避抗癌药物的杀伤过程中,PI3K/ Akt 信号转导通路可能起了极其重要的作用[7,8]。因此本研究将探讨冬凌草甲素是否通过作用PI3K/ Akt 信号转导通路在抑制HeLa 生长，为临床应用提供理论依据。
1 材料与方法
1. 1 细胞培养
人宫颈癌HeLa 细胞株购自上海院细胞中心。HeLa 细胞由含有100 mL/L新生牛血清的RP2MI 1640 培养液于37 ℃、体积分数5%CO2 饱和湿度的细胞培养箱培养,实验使用细胞均为接种后24 h 处于对数生长期细胞。
1.2 诱导细胞凋亡的形态学观察及测量
将细胞用2.5 g/L胰蛋白酶消化,接种至24 孔板中,每孔含细胞数4 × 104 个,每孔0. 5 mL 的完全培养液中,置37 ℃、体积分数为5%的CO2 培养24 h ,更换新鲜培养基。加冬凌草甲素,使药物终浓度分别为0、10、20 mg/L ,继续培养48 h ,加50 g/L多聚甲醛(PBS, pH 7.2) 4 mL ,固定20 min。加入Hoechst 33342 ,使终浓度为5 mg/L,室温暗处静置,去上清液,加PBS (pH 7.2)洗2 次,在多功能倒置显微镜(Nikon TE300) 下观察, 并用Leica DC200 拍照。
1. 3 细胞生长率测定
采用MTT 法检测HeLa 细胞的生长率。取对数生长期细胞,用完全培养液调整细胞数为1×104个/ mL ,接种于96 孔板,24 h 后分别加入终浓度为: 2.5, 5.0, 10.0, 25.0, 50.0 μmol/L的冬凌草甲素作用24 h,同时设置正常对照组(加实验组等体积培养液做对照) ,每组6 复孔，取药物作用24 h 后,每孔加入5 mg/ mL MTT 10 μL ,摇床混匀后,继续培养4 h ,每孔吸出100 μL 上清液,同时每孔加入DMSO(国产) 100 μL ,摇床混匀15 min ,室温静置20 min 后,在酶标仪(波长= 495 nm/ 530 nm ) 测A值,细胞生长率: 细胞生长率=（处理组/正常对照组）×100 %。并且采用上述方法检测25.0 μmol/L 的冬凌草甲素作用0，6，12，24 h后HeLa 细胞的细胞生长率。
1. 4 流式细胞仪检测HeLa细胞凋亡率
将HeLa 细胞数按1×104/mL置于100 mL 培养瓶中,分对照组和药物组,药物组为25.0 μmol/L的冬凌草甲素,分别作用0，6，12，18，24 h后用于流式细胞仪检测，每组6 复孔。细胞凋亡检测:收集对照组和药物组各20 000个细胞，PBS 液洗涤,加入碘化丙啶( PI)工作液0.5 mL (浓度为10 μg/mL) (北京岳泰生物公司) ,室温避光30 min , FACScan流式细胞仪分析和处理数据。
1.5 Western blotting 检测Akt、GSK3、FKHRL的表达
不同浓度的冬凌草甲素(10.0 μmol/L, 25.0 μmol/L, )处理HeLa细胞48 h后,按常规方法裂解细胞,考马斯亮蓝法测定蛋白浓度。用120 g/L十二烷基硫酸钠2聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS2PA GE) 分离蛋白, 电转移至PVDF 膜。用含50 mL/L脱脂奶Tris缓冲液封闭膜上的非蛋白结合点, 4 ℃ 过夜。分别加入1 ∶ 200 稀释的鼠抗人Anti-β-actin抗体、Anti-phospho-Akt 抗体 (Santa Cruz Biotechnology, CA), Anti-phospho-GSK3抗体（Cell Signaling Technologies，Beverly, MA)室温作用4 h。漂洗3 次后加第二抗体(辣根过氧化物酶标记的兔抗鼠IgG抗体)室温作用2 h,漂洗3次。加发光剂(Lumi GLO ),置感光盒中感光,显影,定影。实验重复3次。
1.6 统计处理
数据用ｘ±ｓ表示, 采用统计软件SPSS 10.0 进行数据处理, 组间数据采用t 检验或秩和检验。x
2 结 果
2. 1 冬凌草甲素诱导细胞凋亡的形态变化
在相差显微镜下,对照组细胞界限清晰,胞浆丰富,饱满;在荧光显微镜下,胞核圆形或椭圆形,染色质均匀分布,少见强荧光的胞核(处于染色体聚集的有丝分裂细胞核呈强蓝荧光) 。HeLa细胞被冬凌草甲素处理24 h后,凋亡细胞脱落悬浮于孔板底部; 冬凌草甲素终浓度5.0 μmol/L时,细胞变圆,体积缩小,核呈强荧光的凋亡细胞明显多于对照组;当终浓度25.0 μmol/L时,细胞变圆,体积缩小,表面粗糙,胞核缩小,呈强蓝色荧光,可见染色质浓缩呈斑块状,出现凋亡小体,呈典型的凋亡细胞形态(图1) 。
2.2 冬凌草甲素抑制HeLa细胞生长
HeLa细胞经不同浓度的冬凌草甲素处理24 h后, HeLa细胞数明显减少, 5.0 μmol/L的冬凌草甲素时，细胞的生长率为(86.6±2.5)% , 25.0 μmol/L的冬凌草甲素时，细胞的生长率为(30.9±2.6)%。结果表明HeLa细胞经25.0 μmol/L的冬凌草甲素处理24 h 后, 生长受到明显抑制, 见图2A。25.0 μmol/L 的冬凌草甲素作用12 h后HeLa 细胞的生长受到明显抑制, 见图2B。
2.3 冬凌草甲素诱导HeLa细胞凋亡
25.0 μmol/L的冬凌草甲素作用HeLa细胞0，6，12，24 h 后, 细胞出现不同程度的亚G1峰(凋亡峰) , 作用12 h后诱导HeLa 细胞凋亡明显增加，见图3。
2.4 冬凌草甲素对Akt、FKHRL、GSK3表达的影响
HeLa细胞经过25.0 μmol/L 的冬凌草甲素作用24 h后, western blotting分析表明， HeLa细胞的Akt、FKHRL、GSK3的表达均下调(P< 0.01)。
3 讨 论
冬凌草甲素是从冬凌草中提取出来的一种以贝壳杉烯( ent-kaurene)为骨架的四环二萜类化合物,其化学结构为C20 H26O7。大量资料证明[9] , 冬凌草甲素对EAC、HAC、S180、P388及L1210等多种移植性肿瘤均具有明显的抑制作用,其对实体瘤的目前已广泛的应用于临床,常用于食道癌、胃癌等多种实体瘤的治疗,并且均取得了明显的临床疗效。我们使用冬凌草甲素对宫颈癌HeLa细胞的作用表明, 25 μmol/L以上的冬凌草甲素对宫颈癌HeLa细胞具有明显的生长抑制作用,并能诱导细胞发生凋亡,随着药物浓度的增加和作用时间的延长,细胞的生长抑制率及细胞凋亡率均明显升高, 冬凌草甲素抑制细胞生长及诱导细胞发生凋亡的过程中,细胞端粒酶Akt、FKHRL、GSK3表达水平及活性显著降低,这在既往尚未见资料报道。
宫颈癌的发病机制复杂，是多因素、多基因、多阶段共同参与的结果。其中细胞信号传导对宫颈癌的发生起着至关重要的作用。癌症的发生被认为与信号传导系统的异常激活有关，在诸多的传导途径中，PI3K/Akt通路被认为是癌细胞存活的首要通路，有“抗凋亡途径”之称，近年来备受关注。激活后的Akt 主要通过对含有丝氨酸&苏氨酸残基的底物磷酸化而发挥广泛的生物学效应, 包括抗凋亡、促细胞生存功能。目前已发现多个Akt 底物, 如Bad、Caspase-9、FKHRL、I-?资B 激酶( I-?资B kinase, IKK)、糖原合酶激酶3(glycogen synthase kinase3, GSK3) 以及内皮细胞型一氧化氮合酶等, 这些底物磷酸化后可能通过直接改变凋亡机器组件或间接改变编码凋亡机器组件的基因表达水平, 从而发挥作用。Akt 在不同的细胞系中底物有所不同, 说明其具有一定的细胞特异性[10, 11]。目前Akt 促细胞生存的确切机制尚远未阐明, 对其底物的深入探讨将是研究的热点。本研究发现应用冬凌草甲素可抑制HeLa细胞中Akt和p-Akt蛋白的表达，而且其表达呈浓度依赖性降低，提示冬凌草甲素可通过抑制PI3K活性，抑制Akt的表达及活化，使Akt和p-Akt蛋白的表达降低。FKHR (Forkhea like family) 受PI3K/Akt 通路的调节, 对某些抗凋亡或促凋亡基因有调节作用, 进而诱导细胞凋亡[12]。本研究发现应用冬凌草甲素可抑制HeLa细胞中FKHRL蛋白的表达，而且其表达呈浓度依赖性降低，提示抑制FKHRL活性可能是冬凌草甲素抑制PI3K活性促进HeLa细胞凋亡的作用途径之一。
研究还发现PI3K/Akt与人类多种恶性肿瘤的发生、发展、侵袭、转移有关，细胞及动物实验显示PI3K/Akt的抑制剂可抑制肿瘤的生长。目前认为抑制肿瘤血管生成是PI3K/Akt的抑制剂的作用途径之一[10]。PI3K/Akt调节血管生成的机制可能为:(1)通过激活并磷酸化内皮细胞NO合酶持续性地合成NO，导致新生血管生成，促进VEGF诱导的内皮细胞迁移。(2)通过激活GSK3上调HIF-la的表达，增加VEGF, GLUT1等的表达。(3)AKT还能磷酸化糖原合成酶激酶3(GSK3),使GSK3 受到抑制,而GSK3 能下调β2连环蛋白的表达,而β2连环蛋白能下调E2钙黏素表达,促进细胞运动[10, 13]。我们发现冬凌草甲素抑制细胞生长及诱导细胞发生凋亡的过程中,细胞端粒酶Akt、GSK3表达水平及活性显著降低，提示冬凌草甲素还可以通过抑制GSK3的激活来抑制宫颈癌的发生、发展。
本研究结果表明冬凌草甲素能够通过诱导人子宫颈癌HeLa 细胞发生凋亡而发挥抑制HeLa 细胞生长作用; 抑制PI3K/Akt和GSK3的激活是冬凌草甲素体外诱导人子宫颈癌HeLa 细胞发生凋亡的重要作用机制之一，从而调整细胞增殖与凋亡间的平衡。
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