血管内皮细胞生长因子对骨缺损修复的影响
【摘要】 探讨血管内皮细胞生长因子（VEGF）对肌肉骨膜瓣、松质骨颗粒和骨髓联合移植修复骨缺损中的影响.［方法］制作家兔桡骨骨缺损模型，在缺损区用肌肉骨膜瓣、松质骨颗粒及骨髓进行联合移植，于术后第1、2、4、6、8周时利用光学显微镜和免疫组织化学等方法检测VEGF在骨缺损修复不同阶段中对各种细胞内的表达情况.［结果］VEGF在骨缺损修复过程中的不同阶段的表达程度不同，在术后1～6周时(即软骨内化骨阶段)，新生的骨细胞、成骨细胞及软骨细胞内均可见大量的VEGF，其高峰出现在第4周.［结论］VEGF是骨缺损修复过程中重要的生长因子，联合移植有利于骨缺损的快速修复.
【关键词】 血管内皮生长因子类 骨缺损 骨移植
Effects of vascular endothelial growth factor for repairing bone defect
ABSTRACT:OBJECTIVETo study the expression and effects of vascular endothelial growth factor (VEGF) for combined transplanting the musculoperiosteal flap, bone marrow and spongy bone granules to repairing bone defect.METHODSSegmental bone defect was created in the mid upper of radial shaft of adult rabbits, and combination of musculoperiosteal flap, bone marrow and spongy bone granules was transplanted to the bone defect. VEGF expression in the different phase of repairing bone defect was defected by immunohistochemistry at postoperative of 1, 2, 4, 6, 8 weeks.RESULTSExpression of VEGF was different in the different phase of repairing bone defect. VEGF was expressed in neo?osteocytes, osteoblasts and chondrocytes in the bone defects sites from one to six weeks (phase of os endochondrale) after operation, and the high expression of VEGF was detected at 4 weeks.CONCLUSIONVEGF is key factor in healing bone defects, and combined transplantation makes for repairing the bone defect.
Key words:vascular endothelial growth factors;bone defect;bone transplantation
目前，车祸造成的开放性骨折、骨坏死及骨缺损日益增多，而骨折不愈合及骨缺损是难点.虽然多种方法可用于修复骨缺损，包括自体骨移植、同种异体骨移植及人工骨移植等，但均有弊端.本实验通过肌肉骨膜瓣、松质骨颗粒及骨髓联合移植修复了家兔桡骨骨缺损，并利用免疫组织化学方法观察了修复效果，旨在为临床治疗骨缺损提供依据.
1 材料与方法
取健康家兔30只，体重为2.5～3.0kg，雌雄不限，由延边大学医学部实验动物科提供，分笼饲养.实验前术区备皮，常规消毒，用5g/L利多卡因行局部浸润麻醉，取双前肢前内侧纵行切口，经肌间隙进入，显露桡骨干，截除桡骨中段15mm，制作骨缺损动物模型，选择右前肢为实验肢，左前肢为对照肢.取髂后上棘切口，长度约为20mm，取出15mm×10mm大小的髂骨，刮取其松质骨颗粒备用；于胫骨上段前内侧切开皮肤约10mm,抽取骨髓2.0mL,状态下凝固备用.将实验组旋前圆肌置入骨缺损模型家兔实验肢骨缺损区，并将松质骨颗粒及骨髓植入旋前圆肌组织内，用桡骨骨膜包裹，用5?0无损伤线仔细缝合骨膜，再逐层缝合切口；而对照肢则未给予任何处理，直接缝合.分别于术后1、2、4、6、8周时随机选择模型家兔5只处死，分别于实验肢及对照肢桡骨骨缺损处取材，置于100g/L甲醛溶液固定24h，EDTA脱钙4周，每周换液1次，梯度酒精脱水，石蜡包埋，5μm厚组织切片，行HE及免疫组织化学染色.方法为组织切片脱腊，水化，EDTA热修复，过氧化氢封闭非特异性抗原，PBS冲洗3次，滴加第一抗体，4℃过夜；冲洗3次，滴加第二抗体，室温孵育10min；PBS冲洗3次，滴加辣根酶标记链霉卵白素，室温孵育10min；PBS冲洗3次，DAB显色，梯度酒精脱水，二甲苯透明，封片.
2 结果
2.1 HE染色表现 术后第1周对照肢炎性细胞减少，有少量纤维组织形成；第2～4周，缺损组织中纤维组织大量形成，但排列紊乱，伴有少量软骨细胞增生；第4～6周，缺损组织中纤维组织排列整齐，可见软骨细胞及少量类骨样组织，呈软骨内化骨；第8周，缺损组织中可见软骨细胞，仅在骨折端可见骨痂形成，中间仍有纤维结缔组织.术后第1周实验肢缺损组织中可见大量的间充质细胞形成；第2周，可见大量间充质细胞向软骨细胞分化，同时有大量软骨细胞团形成；第4周，可见大量软骨细胞与条索状的新生骨细胞，仍有大量增殖的间充质细胞；第6～8周，缺损组织中软骨内化骨已形成完整的骨组织.
2.2 VEGF的影响 术后第1周对照肢取材组织的炎性细胞、成纤维细胞及血管内皮细胞内可见大量的VEGF；第2～4周，在骨折端成纤维细胞、血管内皮细胞及软骨细胞内可见大量的VEGF(图1A)；第4～6周，在血管内皮细胞及软骨细胞内可见少量的VEGF；第8周，在取材组织中未见VEGF.术后第1、2周时实验肢成纤维细胞、血管内皮细胞及软骨细胞内可见大量VEGF；第2～4周，骨折端组织血管内皮细胞及软骨细胞内仍可见较多VEGF(图1B)；术后第6周，大量的软骨细胞内仍可见VEGF；术后第8周，在骨细胞中未见VEGF.
3 讨论
目前，骨折后缺损骨修复的确切机制尚未十分清楚，而骨不连的预防与亦是骨科难题.骨折修复是由多种因素参与的复杂的生物学过程，而与成骨有关的血管形成和成骨细胞活性的保持有赖于成骨因子的刺激素［1］.VEGF糖蛋白，分子质量为34～45ku，可由多种哺乳类动物及人类的胚胎和成年组织中产生，可通过旁分泌强烈地刺激体内新生血管的生成，增加血管通透性，对维持血管的正常状态和完整性具有重要意义［2，3］.VEGF是目前已知的众多血管生长因子中作用最强［4］，其他促血管生成因子的作用均直接或间接地通过增强VEGF表达来实现.本实验用肌肉骨膜瓣、松质骨颗粒和骨髓联合移植修复长段骨缺损，并用HE、免疫组织化学染色和原位杂交的方法观察了骨缺损的修复时间与VEGF在细胞内表记情况.实验结果表明，在早中期骨缺损模型家兔实验肢缺损处组织中可见大量的毛细血管形成，并伴有移植骨的吸收和软骨细胞的形成，在中后期见大量的软骨内化骨形成，骨组织进一步得到重建，一些软骨细胞也经钙化，骨髓腔已初步形成；原位杂交结果显示，实验肢及对照肢家兔缺损处组织细胞内均可见大量的VEGF，但实验肢较对照肢多.本实验结果提示，VEGF在肌肉骨膜瓣、松质骨颗粒和骨髓联合移植修复长段骨缺损修复过程中，具有促进软骨细胞的分化增殖及软骨内化骨作用，是骨缺损修复的重要生长因子，联合移植有利于骨缺损的快速修复.
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