自体游离骨膜移植修复家兔关节软骨缺损的形态学研究

【摘要】  ［目的］观察并分析移植自体游离骨膜修复家兔关节软骨缺损的形态学变化过程.［方法］在18只家兔双侧膝关节股骨髌面上制作6.0mm×3.0mm大小的全层关节软骨缺损模型，行胫骨内侧面骨膜片移植，利用显微镜及图像分析技术观察股骨髌面关节软骨缺损修复的形态学变化.［结果］术后第4周时，自体游离骨膜组可见明显的软骨陷窝及同源细胞群，第12周时，细胞密度降低，基质增多，接近正常透明软骨的特征.自体游离骨膜移植组在术后第4，8，12周时平均单个软骨细胞面积与对照组相比较均有显著性差异.［结论］移植自体游离骨膜可修复关节软骨缺损，其过程可分为细胞分化增殖期、幼稚软骨形成期及软骨改造塑形期等3个阶段.

【关键词】  骨膜 移植 自体 兔

    Study of morphological changes in repairing articular cartilage defects with transplanting autologous free periosteum

    ABSTRACT:OBJECTIVETo observe and analyze the process of morphological changes in repairing articular cartilage defects with transplanting autologous free periosteum.METHODSUsing the models of 6.0mm×3.0mm of full thickness of articular cartilage defects on the patellar surface of femur established in 18 cases of knee joint of Chinese rabbits, the autologous free periosteum was transplanted into the facies medialis tibiae, and the morphological changes were observed in repairing articular cartilage defects with transplanting autologous free periosteum on the patellar surface of the femur by microscope and image analysis.RESULTSDistinct cartilage hollows and homologous cell mass were revealed when 4 weeks after operation. The characteristics similar with normal hyaline cartilage were revealed by decreasing of cell density and increasing of cell matrix when 12 weeks after operation in the transplanting group of autologous free periosteum. There were significant differences between the transplanting group of autologgous free periosteum and control group on the single cartilage cell area when 4 weeks, 8 weeks and 12 weeks after operation respectively.CONCLUSIONThe transplantation of autologous free periosteum could repair articular cartilage defect, and its course can be devided into three periods, including cell differentiation and proliferation, formation of immature cartilage and the cartilage transformation and shaping.

    Key words:periosteum;transplantation, autologous;rabbits

    关节软骨缺损的移植修复是热点研究课题，本实验在中国家兔股骨髌面建立了自体游离骨膜移植修复关节软骨缺损模型，并利用显微镜及图像分析技术观察并分析了自体游离骨膜修复关节软骨缺损的形态学变化，旨在为自体游离骨膜移植的临床应用提供实验依据.

    1  材料与方法

    1.1  动物与分组  选取体重为（2.15±0.30）kg的健康中国家兔18只，雌雄不限.利用自制手术刀在家兔股骨髌面制作6.0mm×3.0mm大小的股骨髌面全层软骨缺损模型，深度以均匀出血为准，共36侧.随机选择28侧为自体游离骨膜移植组，在关节软骨缺损区内铺盖从胫骨内侧面锐性剥离的8.0mm×4.0mm大小的骨膜片，使生发层朝向关节腔，用6号缝合线将四角缝合于膝关节面周围的结缔组织上；选择8侧为无移植对照组，其关节软骨缺损区内未植入任何组织.

    1.2  标本制作  分别于术后等1，2，4，8，12周时取材，行常规苏木精?伊红染色、阿尔辛蓝?过碘酸雪夫反应及阿尔辛蓝?丽春红组合染色.

    1.3  观测方法  利用日本OLYMPUS光学显微镜对移植组织标示修复细胞的形态变化进行观察，并采用北京航空航天大学产CMIAS?008型多功能真彩病理显微图像分析仪测量单个软骨细胞的面积.每块标本分别在高倍镜下取3个视野，再生细胞面积平均值作为每块标本的参数值，进行定量分析.

    2  结果

    2.1  光学显微镜观察  术后第1周自体游离骨膜移植组标本移植骨膜增生，生发层骨原细胞大量增生、分化，体积变大，多呈扁椭圆形，核大，呈卵圆形，染色较深，胞质嗜碱性；对照组标本缺损区内形成较薄的肉芽状组织.第2周时，自体骨膜移植组标本游离骨膜明显增厚，细胞密度增加，呈圆形或卵圆形，核大，偏居一侧，偶尔可见较小的软骨囊、软骨陷窝及双细胞；对照组标本深层可见小血管形成，周围见成纤维细胞，在浅层有散在的扁椭圆形细胞.第4周时，自体游离骨膜组标本细胞密度降低，基质增多，可见明显的软骨陷窝和同源细胞群(图1)；对照组标本浅层细胞明显增多，体积较小，呈卵圆形，核较大，胞质少.第8周时，自体游离骨膜移植组标本浅层可见多层卵圆形细胞，随深度的增加体积逐渐变大，中间层和深层细胞垂直于表面排列，多个细胞成行位于软骨陷窝内，细胞大小不一，形态各异，胞质丰富，呈嗜碱性，基质增多，软骨囊明显，PAS反应呈阳性(图2)；对照组标本成纤维细胞增多，基质中胶原纤维明显增多，散落的软骨细胞减少，大部分位于浅层，仅少部分散在于中间层.第12周时，自体游离骨膜移植组标本细胞密度降低，基质增多并有少量的胶原纤维，接近正常透明软骨的特征；对照组标本大部分被瘢痕组织修复，在浅层仍可见体积较小的软骨细胞(图3).

    2.2  图像分析  术后第4周时，自体游离骨膜移植组再生组织中的平均单个软骨细胞面积明显增大，第8，12周时则减少；对照组标本平均单个软骨细胞面积变化不明显.第4，8，12周时对照组标本平均单个软骨细胞面积与自体游离骨膜移植组比较均有显著性差异(P＜0.05)，见表1.表1  术后不同时间单个软骨细胞面积

　　3  讨论

    近年来，众多学者通过游离骨膜移植修复关节软骨缺损的研究证明了骨膜可生成关节软骨［1］.在胚胎发育过程中，骨膜是由软骨膜衍化而来，两者的生发层均含有未分化间充质细胞，组织结构存在某些相似性.未分化间充质细胞具有分化为骨细胞及软骨细胞的双重能力［2］，而它的分化趋势决定于周围环境，在一定条件下，不仅骨膜内的未分化间充质细胞可化生为关节软骨，且骨膜生发层的骨原细胞在低氧环境中亦可化生为关节软骨［3］.骨膜被移植到关节腔后，在低氧环境和滑液的营养及局部应力条件下，原处于静止状态的细胞可迅速增殖分化为软骨母细胞，后者分泌细胞间质并被包埋而成为软骨细胞，移植的骨膜逐渐化生为软骨组织［4］.本实验结果表明，移植到缺损区的自体游离骨膜均化生为透明软骨.移植骨膜内的未分化间充质细胞和生发层细胞增殖分化为软骨组织是一个连续的过程，根据组织形态学特点可分为3个阶段：1）细胞分化增殖期，移植后第1，2周，骨膜增生增厚，生发层的骨原细胞和未分化间充质细胞增殖分化成椭圆形或卵圆形细胞，核较大，染色深，胞质呈嗜碱性；2）幼稚软骨形成期，移植后第2～8周，在新生组织中可见大量幼稚软骨细胞及透明软骨细胞簇，从表到里，细胞体积逐渐变大，可见软骨囊和软骨陷窝，基质逐渐增多，可见有中性黏液物质和胶原纤维出现，与周围组织连接较好；3）软骨改造塑形期，移植后8～12周，细胞周围出现明显的软骨陷窝和软骨囊，新生软骨的厚度、细胞密度及细胞排列接近于正常关节软骨，并与周围正常软骨间完全连接，表面光滑.

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  ［1］ 雷学峰，王强，杨古义，等.兔自体游离骨膜移植修复关节软骨缺损的远期效果观察［J］.济宁医学院学报，2004,27(4):6.

［2］ 马树强，炬海鹏，王坤正，等.骨?骨膜复合组织与软骨下钻孔关节软骨缺损的实验研究［J］.陕西医学杂志，2004,33(5):390.

［3］ 姜哲，崔春爱，姜正二.自体红骨髓?骨膜碎片复合移植修复关节软骨缺损的形态学研究［J］.延边大学医学学报，2003,26(2):89.

［4］ 崔春爱，金东洙，金范学.关节软骨缺损修复细胞的体视学变化［J］.延边大学医学学报，2003,26(2)：94.?