VEGF基因在骨缺损模型家兔骨修复中的表达动态分析

【摘要】  ［目的］动态分析骨缺损修复过程中血管内皮生长因子(VEGF)基因表达量与骨缺损修复时间的关系.［方法］取新西兰家兔30只，于右侧桡骨钻出直径为20mm的骨组织,制作骨缺损模型，钻取自体髂骨骨颗粒，并移植于右侧桡骨骨缺损区域.分别于术后3d、1周、2周、4周、6周、8周时处死动物取材，行逆转录?聚合酶链反应（RT?PCR），观察并分析骨缺损修复过程中VEGF基因表达量.［结果］术后第3日、1周、2周、4周、6周、8周时骨缺损区域VEGF基因的相对表达量分别为2.08， 1.00，0.88，3.40，1.71，1.17.［结论］VEGF基因在骨缺损修复过程中发挥重要作用，它的表达量在术后3d及第4周时出现高峰.

【关键词】  血管内皮生长因子；骨缺损；聚合酶链反应

    Dynamic quantification analysis of expression of VEGF gene in repairing of   bone defect of rabbit model

    ABSTRACT:OBJECTIVETo study the relationship between expression of vascular endothelial growth factor(VEGF) and time of reparing of bone defect.METHODS20mm standard bone defect modal was processed in the right middle radial shaft of rabbit in 30 New Zealand rabbits. The spongy bone was transplanted from ilium to repair right radius defect for 3 days, 1, 2, 4, 6, 8 weeks after operation.RESULTSThe experimintal group was 2.08 after 3 days,  1.00 after 1 week and 0.88 after 2 weeks,  3.40 after 4 weeks, 1.71 after 6 weeks, 1.17 after 8 weeks.CONCLUSIONThe VEGF gene pays an important role in reparing of bone defect, and its expression is high peak in 3d and 4 weeks after operation.

    Key words:vascular endothelial growth factor;bone defect;pdymerase chain reaction

    骨组织的愈合是骨折或骨缺损的修复过程，分为组织修复期、原始骨痂形成期、成熟骨板期及塑形期.骨折的愈合有多种生长因子参与，其中血管内皮生长因子(vascular  endothelial grouth factor, VEGF)基因在骨的生长和发育、再生及修复等生理病理过程中起重要作用.本研究通过制作家兔骨缺损模型，对VEGF基因在骨修复中的表达进行了动态分析，探讨了骨缺损修复过程中VEGF基因表达量与修复时间的关系.

    1  材料与方法

    1.1  动物模型的制作  实验动物取家兔(新西兰)30只，体重为2.0～2.5kg，由延边大学医学部实验动物科提供，雌雄不限.在无菌状态下用骨磨钻于家兔右侧桡骨处钻出直径为20mm的骨组织,制作骨缺损模型,于髂骨钻取直径为1.0～2.0mm的骨颗粒，将其移植于右侧桡骨骨缺损区.术后肌肉注射给予0.1g/kg头孢唑啉钠,连续4d.分别于手术后3d、1周、2周、4周、6周及8周时处死动物,每次5只，剖取骨缺损区移植物标本,迅速置入液氮中，取出,研磨，用Trazol法提取mRNA构建扩增，备用.

    1.2  方法  PCR相关试剂为大连TAKARA公司产品.采用Real Time PCR法检测各组的基因相对表达量，将兔子骨Total RNA（大连大学提供）作为管家基因（GAPDH）的RNA标准品,以体外转录构建的RNA作为目的基因（VEGF）的RNA标准品，将家兔骨Total RNA(500ng)反转录获得的cDNA用EASY Dilution按10倍梯度稀释作为模板，进行Real Time PCR反应，绘制管家基因的标准曲线.将体外构建的VEGF目的基因RNA标准品反转录获得的cDNA用EASY Dilution按10倍梯度稀释作为模板.取1.1项下扩增样品进行PCR检测,分别与管家基因及目的基因标准曲线相比较，进行相对表达量分析.

    2  结果

    GAPDH及VEGF基因标准曲线见图1及图2.VEGF目的基因在94℃ 30s,55～65℃ 30s,72℃ 1min的条件下,共进行30个循环,其后72℃延伸2min.将扩增物分别进行琼脂糖凝胶电泳,结果在骨缺损修复3d、1周、2周、4周、6周、8周时分别为4446，2061，1611，1048，245，578bp.以1周循环次数为基础，3d、1周、2周、4周、6周、8周时其比值分别为2.08,1.00,0.88,3.40,1.71,1.17,见表1.图1  GAPDH管家基因扩增标准曲线图2  VEGF目的基因扩增标准曲线表1  VEGF基因相对表达量

    管家基因GAPDH定量结果相对表达量*目的基因VEGF定量结果校正结果相对表达量*3d338701.0444462.162.081周324601.0020611.001.002周288950.8916110.780.884周48440.1510480.513.406周23990.072450.121.718周77690.245780.281.17* 相对表达量为以1周时循环次数为基础得出的比值

    3  讨论

    骨缺损通常由外伤、感染、恶性肿瘤及人工关节翻修手术等所致［1］,骨缺损的修复,特别是大段骨缺损的修复是骨科的难题[2]，每年在美国650万例骨折患者中发生延期治疗者为10%～15%[3,4].新血管形成可能与诸多因素相关，如成纤维细胞生长因子、转化生长因子α,β及肿瘤坏死因子等［5］,其中血管内皮生长因子可特异性地作用于内皮细胞[6～8].初同伟[9]报道，骨折断端存在VEGFmRNA高表达，且高表达贯穿于骨折愈合的全过程.本实验制作了家兔桡骨骨折模型，并用自体髂骨骨松质对缺损区进行修补，采用Real Time PCR方法观察了骨缺损修复时间与VEGF基因表达量的动态关系.实验结果表明,术后第3日、1周、2周、4周、6周及8周时VEGF基因的相对表达量分别为2.08，1.00，0.88，3.40，1.71，1.17，提示术后3d时血管内皮生长因子的表达迅速增强，其原因可能与机体受到外伤后发生应急反应有关;第4周时VEGF基因表达再次出现高峰，其原因可能与移植区坏死骨被吸收，新生成软骨细胞及基质分泌的VEGF增多有关.综上所述，VEGF基因在骨缺损模型家兔修复中发挥重要作用，而它的表达量在修复过程中发生变化.

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