吸入汽油废气颗粒大鼠再行卵蛋白攻击后哮喘速发相反应变化

           作者：元熙哲，李今子，金正勇，池永学，尹永日

【摘要】  ［目的］观察吸入不同时间长度汽油废气颗粒（DEP）的大鼠行卵蛋白攻击后哮喘速发相反应的变化.［方法］选择雄性Wistar大鼠，随机分为6个组，其中A组给予生理盐水攻击，B组给予卵蛋白攻击，C，D，E，F组分别给吸入DEP各1，2，3，4周后再行卵蛋白攻击.抗原攻击结束1周后除A组外的其他各组大鼠给予卵蛋白激发30min，测量气道阻力5min.观察肺泡灌洗液中炎症细胞及血清总IgE值的变化，检测肺组织中IL?5和IFN?γ水平.［结果］抗原激发后B，C，D，E，F组大鼠气道阻力均高于A组，E，F组明显高于B组；气道阻力的增高程度和DEP的吸入时间呈正相关.除A组外的各组大鼠肺泡灌洗液中均可观察到大量炎症细胞浸润，包括嗜酸性粒细胞、中性粒细胞、淋巴细胞和巨噬细胞，以前两者为主.嗜酸性粒细胞体积分数在B组与A组之间及E，F组与B组之间差异均有统计学意义；中性粒细胞体积分数在A，B，C，D组之间无显著性差异，但E，F组较A，B组显著增高.B，C，D，E，F组大鼠血清总IgE值较A组显著增高，F组与B组间差异亦有统计学意义；D，E，F组大鼠肺组织中IL?5水平较A，B组显著增高.［结论］吸入DEP大鼠再行卵蛋白攻击后哮喘速发相反应明显增强，反应增强程度与DEP吸入时间呈正相关.

【关键词】  哮喘；车辆排放物；卵蛋白质类；大鼠

    ABSTRACT:OBJECTIVETo observe the change of early reaction of the rat resensitised by ovalbumin after preinhaled diesel exhaust particulates(DEP).METHODSMale rats were randomly divided into 6 groups.  Group A was sensitizated with saline and group B was sensitizated with ovalbumin. The groups C，D，E and F were inhaled with DEP for 1 week, 2 weeks, 3 weeks and 4 weeks, respectively, and after DEP inhalation once more sensitizated with ovalbumin. After 1week of end of antigen sensitization, except group A another groups were challenged with ovalbumin 30 minits，and observe change of lung function for 5 minits. Finally observe change of inflammation cell in alveolus lavage fluid, serum overall IgE, concentra tion of IL?5 and IFN?γ  in lung tissue.RESULTSThe airway resistance was more increased in group B, C, D, E and F than in group A, and group E and F was more increased than group B after antigen challenge. The degree of airway hyperresponsiveness depended on the inhalation time. There were many infiltration of inflammatory cells except group A, including eosinophil, neutrophil, lymphocyte and macrophase, eosinophil and neutrophil were major. Eosinophils increased in group B than in group A, in group E and F than in group B, and the difference was a significant. Neutrophils were no significant difference among group A, B, C, D, but more increased in group E and F than in group A and B, and there was significant difference. Serum IgE concentration was more increased in group B, C, D, E and F than in group A and more in group F than in group B, there was significant difference. IL?5 concentration of lung tissue was more increased in groups D, E and F than group A,B,  there was significant difference.CONCLUSIONThe DEP inhalation could enhance the level of early reaction obviously after ovalbumin resensitised rat, and  the level of the early reaction’s enhance has positive correlation with DEP inhalation time.

    Key words:asthma;vehicle emissions;egg proteins;rats

    近年来，哮喘的发病率呈逐年升高的趋势,其主要原因之一是空气污染，而汽油废气颗粒（diesel exhaust particle， DEP）是主要的空气污染源之一.随着和汽车业的，由DEP引起的空气污染日益严重，所引发的哮喘也日益受到重视.本研究通过动物实验，探讨了DEP与哮喘的关系，旨在为哮喘的预防与提供实验依据.

    1  材料与方法

    1.1  实验动物  取雄性Wistar种大鼠，为清洁级，由吉林大学实验动物中心提供，体重为150～180g.

    1.2  方法

    1.2.1  DEP的吸入与卵蛋白攻击  将60只Wistar大鼠随机分为A，B，C，D，E，F 6个组，每组为10只.每日给A组大鼠吸食生理盐水共4周，每日1h，4周后腹腔注射给予生理盐水（每次0.5mL）,每周1次，共3次，末次注射24h后以6.0mL/min流量雾化吸入生理盐水，每日1h，共1周；腹腔注射给予B组大鼠含卵蛋白100mg及氢氧化铝100mg的复合物1mL,每周1次，共3次，末次注射24h后雾化吸入30g/L卵蛋白溶液，每日1次，每次30min，连续1周；C,D,E,F组为观察组，分别雾化吸入含100mg/L DEP的生理盐水溶液各1,2,3,4周，每日1次，每次1h，末次吸入结束后再行卵蛋白攻击，方法同B组.

    1.2.2  气道高反应性的测定  攻击结束1周后B，C，D，E，F组用30g/L卵蛋白激发30min，A组用生理盐水，行乙醚麻醉及气管插管，连接呼吸流量传感器（型号为HX102，四川省成都市仪器厂产品）及多道生理信号采集处理系统（型号为RM?6240，四川省成都市仪器厂产品），测量气道阻力5min，取平均值进行比较.

    1.2.3  血清总IgE值测定及肺泡灌洗液的收集  剖开胸腔，心脏采血，离心（1200r/min）分离血清，测定总IgE水平.气管内插管，注入生理盐水5mL,轻轻按摩双侧肺脏，收集灌洗液.取少量灌洗液涂片，干燥，行姬母萨染色，在显微镜下观察炎症细胞侵润情况.剖取一侧肺组织，快速冷冻保存于-70℃冰箱,待测IFN?γ,IL?5质量浓度.

    1.2.4  统计学处理  采用SPSS13.0统计软件进行分析.数据均以均数±标准偏差(±SD)表示，进行单因素方差分析和相关性分析.

    2  结果

    2.1  气道阻力变化  A,B,C,D,E,F组抗原激发后气道黏滞阻力（kPa/(L·s)）分别为(357±21),(709±56),(658±44),(750±38),(910±48),(1089±65).B,C,D,E,F组气道阻力与A组比较均明显增高，均有显著性差异;E，F组与B组相比较亦明显增高，相比较有显著性差异（F=167.08,P＜0.01）.

    2.2  肺泡灌洗液中嗜酸性粒细胞和中性粒细胞的百分率  在除A组之外的各组大鼠肺泡灌洗液中均可见大量炎症细胞浸润，包括嗜酸性粒细胞、中性粒细胞、淋巴细胞和巨噬细胞，以前两者为主.A～F组嗜酸性粒细胞依次为0,（0.033±0.011）,（0.066±0.029）,（0.076±0.029）,（0.101±0.029）,（0.115±0.036），可见嗜酸性粒细胞逐渐升高，经统计学分析见B组与A组间及E,F组与B组间比较均有显著性学差异（F=16.96,P＜0.01）.各组大鼠肺泡灌洗液中中性粒细胞为（0.043±0.020）,（0.097±0.052）,（0.103±0.056）,（0.130±0.052）,（0.426±0.103）,（0.553±0.069），亦逐渐增高，经统计学分析见A,B,C，D组间差异无统计学意义，E,F组与A,B组相比较均有显著性差异（F=36.32,P＜0.01）.

    2.3  血清总IgE含量  各组IgE质量浓度(ng/L)依次为(20.2±2.1),(23.0±2.80),(23.3±3.7),(22.8±3.7),(23.5±2.0),(25.0±1.2).B，C，D，E，F组大鼠血清总IgE质量浓度与A组比较均明显增高，F组与B组间差异亦有统计学意义（F=2.49,P＜0.05）.

    2.4  肺组织IL?5和IFN?γ含量  由表1可见，D,E,F组大鼠肺组织中IL?5质量浓度较A，B组明显增高，相比较均有显著性差异（F=4.26,P＜0.05）；F组大鼠肺组织中IFN?γ质量浓度与A，B组比较均明显降低，相比较有非常显著性差异（P＜0.01）.表1  各组大鼠肺组织中IL?5和IFN?γ质量浓度比较

　　3  讨论

    空气污染是引发或加重哮喘的重要因素，其中DEP是发达和家空气污染物的主要成分之一[1].哮喘发作分为速发型和迟发型，两者在临床特征和发病机制等方面均有差异[2，3].目前，国内外对速发型哮喘的研究报道较少，国外多数研究将接触抗原后在3h内症状加重定为速发型哮喘[3，4].本研究中给大鼠吸入不同时间的DEP以后再用卵蛋白攻击，最后用卵蛋白激发30min，再观察DEP对速发相反应的影响.结果表明，B组大鼠气道阻力较A组明显增高，E，F组较B组亦明显增高,而气道高反应性和DEP吸入时间呈正相关，提示DEP可增强哮喘大鼠速发相反应中的气道阻力.据报道,DEP可使正常小黑鼠的气道阻力明显增加[5]，而卵蛋白是制作哮喘模型常用的抗原，可引起气道高反应性.吸入DEP一方面通过对气道黏膜的损伤直接导致大鼠气道高反应性，另一方面促进Th2淋巴细胞活性，增强气道反应性.Diaz?Sanchez等[6]报道，DEP可促进IgE介导的Ⅰ型变态反应，而其正是哮喘的主要发病机制之一.本研究结果表明,大鼠肺泡灌洗液中有嗜酸性粒细胞浸润及肺组织IL?5水平增高，亦进一步提示DEP可促进IgE介导的变态反应.参与哮喘早发相反应的炎症细胞有肥大细胞及嗜碱性粒细胞等，迟发相反应的主要炎症细胞为嗜酸性粒细胞[7].本研究结果表明，在早发相反应中就有较多的嗜酸性细胞浸润，而到吸入3，4周时此现象更为明显，考虑可能是因哮喘模型制作方法和激发时间的差异所致，即每个研究者制作哮喘模型时攻击所用卵蛋白量（或质量浓度）及激发时间不同.通常抗原激发后血液中嗜酸性细胞定位到各组织和器官在1h内，如果抗原攻击浓度升高或激发时间延长则诱发速发相反应中嗜酸性粒细胞浸润较多.另外，吸入DEP可能促进血液中的嗜酸性粒细胞浸润到肺组织，也可促进组织中原有的嗜酸性粒细胞分化.嗜酸性粒细胞的生成分化及浸润均需IL?5，GM?CSF，eotaxin等因子的调节[8]，吸入DEP4周后IL?5水平较正常组和哮喘模型组增高，提示DEP可促进IL?5的生成，加重哮喘反应.过敏性炎症反应是由Th1和Th2淋巴细胞平衡失调引起，当由Th2淋巴细胞分泌的IL?5水平升高时，Th1淋巴细胞分泌的IFN?γ则减少[8].总之，吸入DEP通过直接和间接作用，可促进哮喘大鼠气道高反应性、炎症细胞浸润及IgE生成，加重哮喘速发相反应.

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[5] 元熙哲，金正勇，池永学，等.汽油废气颗粒吸入致C57BL/6小黑鼠哮喘样变化［J］.实用儿科临床杂志，2007，22（9）：654.

[6] Diaz?Sanchez D， Tsien A， Fleming J， et al..Combined diesel exhaust particulate and ragweed allergen challenge markedly enhances human in vivo nasal ragweed?specific IgE and skews cytokine production to a T helper cell 2?type pattern［J］.J Immunol，1997，158：2406.

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[8] Dorman SC, Babirad I, Post J, et al..Progenitor egress from the bone marrow after allergen challenge:role of stromal cell?derived factor 1 alpha and eotaxin［J］.J Allergy Clin Immunol,2005,115:501