电针对脑缺氧缺血新生大鼠海马结构Ｎｅｓｔｉｎ与Ｂｒｄｕ表达的影响

[摘要] 目的：通过观察电针对脑缺氧缺血新生大鼠海马结构中神经上皮干细胞蛋白(Nestin)与5-溴-2-脱氧脲嘧啶(Brdu)表达的影响，了解电针对脑缺氧缺血后神经发生水平的干预，为电针穴位疗法的临床应用提供实验依据。方法：100只7日龄健康Wistar大鼠，体重12～15 g ，随机分为4组：空白对照组、模型判定组、缺氧缺血组与缺氧缺血后电针组，各组动物(除空白对照组外)分别结扎左侧颈总动脉，然后将动物置于8%O2-92%N2混合气中2 h 后取出。模型判定组动物在缺氧缺血48 h后处死，制备脑组织切片。脑缺氧缺血后电针组在缺氧缺血后恢复2 d，开始刺激“百会”和“大椎”两穴。24 d后除模型判定组外，各组动物分别取左侧脑组织制作标本，行Nestin与Brdu免疫组化染色。结果：脑缺氧缺血后电针组海马CA1区Nestin免疫阳性细胞数高于正常对照组及脑缺氧缺血组(P＜0.05)。脑缺氧缺血后电针组齿状回Brdu免疫阳性细胞数高于正常对照组及高于脑缺氧缺血组(P＜0.05)。结论：电针穴位治疗可明显提高(加强)脑缺氧缺血后海马结构神经发生的水平(能力)。
[关键词] 电针；缺氧缺血；Nestin；Brdu
　　
　　[Abstract] Objective: To observe the influence of electroacupuncturing on the Nestin and Brdu expressions in the hippocampal formation of neonatal rats with hypoxia-ischemia, and to confirm the effect of electroacupucture(EA) on HIBD (Hypoxic-ischemic brain damage) in neonatal rats, and then provide the theoretical basis for clinical application. Methods:7 days old Wistar rats(n=100), weighing 12-15 g, were randomly divided into four groups: the control group, the model group, HIBD group and electroacupucture(EA) group. Except the control group, the other three groups were prepared by left common carotied artery ligation and systemic hypoxia (8% oxygen in nitrogen) for 2 h. Then the rats in model group were sacrificed. After 2 d of recovery, the rats in electroacupucture group were treated with electroacupucture (“baihui” and “dazhui”points) every day till the rats were sacrificed 22 d after HIBD. The rest rats were subjected to perfusion-fixation 22 d later, the left brains were regularly paraffin wax embedded, sectioned and stained by Nestin and Brdu immunohistochemical staining. Results: Nestin-positive cells distributed widely in the hippocampal CA1，CA2，CA3 and dentate gyrus of hippocampus formation in each neonatal rat brain. The number of Nestin-positive cells in the electroacupucture group increased markedly, as compared with normal control group and HIBD group. The Brdu-positive cells were mainly located in subventricular zone of lateral wall, subgranular zone of dentate gyrus and corpus callosum in each neonatal rat brain. In the rats of EA group, the Brdu-positive cells were conspicuously higher than those in the normal control group. Conclusion: Eectroacupucture compared with hypoxia-ischemia gives conspicuously rise to enhance neurogenesis in the hippocampal formation of neonatal rats after hypoxia-ischemia.
　　[Key words] Electroacupuncture; Hypoxia-ischemia; Nestin; Brdu
　　
　　新生儿缺氧缺血性脑损伤(Hypoxic-ischemic brain damage,HIBD)是导致新生儿脑部发育不良及智力低下的常见原因。由于高危妊娠及新生儿抢救存活率的升高，不同程度的HIBD的发病率有增高趋势，且目前对此病尚无特殊的治疗方法，故此病成为近年来国内外的研究热点之一。丁春华等[1]的实验提示，电针治疗可促进窒息脑瘫幼鼠脑部血液循环，减弱NO对神经细胞的损伤作用，减少后遗症的发生，促进脑瘫肢体的功能恢复。Gao等[2]的研究表明，电针能促进猕猴局灶性脑缺血后自发脑电(EEG)的恢复，增加脑的血流量，减小梗死区面积，减轻脑组织肿胀程度。陈志强等[3]在脑缺血再灌大鼠模型的缺血后期进行电针，使SOD活性增高，MDA含量下降，脑水肿程度亦有一定控制，提示脑缺血再灌流损伤有明显的预置性保护性作用。以上研究说明，电针刺激可提高脑的抗损伤能力，加快损伤修复。有关脑缺氧缺血新生大鼠电针穴位治疗后对受损脑组织发育的远期影响则少有报道。本实验采用国际公认的新生大鼠HIBD模型，观察电针同时刺激“百会”、“大椎”两穴，应用免疫组织化学方法检测神经上皮干细胞蛋白(Nestin)和5-溴-2-脱氧脲嘧啶(Brdu)在大鼠脑内海马结构中的表达水平，以进一步明确电针穴位疗法对脑缺氧缺血后神经发生水平的干预作用，为电针治疗新生儿缺氧缺血性脑病及预防后遗症提供实验依据。
　　 
1 材料与方法
　　1.1 实验分组及模型制作
　　7日龄健康Wistar大鼠100只(由河南省实验动物中心提供)，体重12～15 g，随机分为4组：空白对照组(25只，存活23只，颈部正中切口，不结扎左侧颈总动脉，不做低氧处理)、模型判定组(25只，存活20只)、缺氧缺血组(25只，存活22只)和缺氧缺血后电针治疗组(25只，存活24只)，各组动物分别结扎左侧颈总动脉，然后将动物置于8%O2-92%N2混合气中2 h 后取出，具体步骤参照[4]。
　　1.2 标本制作与染色
　　模型判定组动物在缺氧缺血48 h后处死，制备脑片及脑组织切片，应用TTC及HE染色判定模型是否成功，具体步骤参照文献[4]。脑缺氧缺血后电针组在缺氧缺血后恢复2 d，开始刺激“百会”和“大椎”两穴。将针柄分别连接至电刺激仪的电极上(电针刺激参数：频率16 Hz，强度10 mV)，留针10 min，治疗2个疗程，每个疗程10 d，两疗程间间隔2 d，穴位定位、针刺参数及疗程参照文献[1,5,6]。24 d后除模型判定组外各组动物分别灌注取左侧脑组织，常规石蜡包埋、切片，行Nestin和Brdu免疫组化染色，光镜下观察海马结构的阳性细胞分布、计数定量分析，除模型判定组外各组动物于处死前2 d的电针治疗前及处死前2 h，分别注射Brdu以标记处于增殖状态的神经前体细胞。Brdu溶于0.01 mol/L PBS中，注射前配制，按50 mg/kg体重腹腔注射。
　　1.3 统计学方法
　　数据以均数±标准差(x±s)表示。先对每组数据做正态性检验，再做方差齐性检验。若方差齐，则做单因素方差分析和q检验；若方差不齐，则进行变量转换。使用SPSS 10.0统计软件对数据进行分析，P＜0.05表示差异有统计学意义。
　　2 结果
　　2.1 TTC功能性酶组织染色
　　模型判定组动物的脑片经TTC功能性酶组织化学染色后，其左侧大脑半球的大部分脑实质着色浅呈苍白色，而右侧大脑半球染成深红色，提示模型成功。
　　2.2 Nestin免疫组织化学染色
　　高倍镜下(10×40倍视野)Nestin免疫阳性细胞呈纤维状，胞体较小，突起且较少，可见明显的锥状突起，染色较淡。细胞计数显示，脑缺氧缺血组和脑缺氧缺血后电针组海马CA1区Nestin免疫阳性细胞均较正常对照组增多，脑缺氧缺血后电针组海马CA1区Nestin免疫阳性细胞较脑缺氧缺血组增多，两两比较差异均有统计学意义(P<0.05)（表1）。
　　2.3 Brdu免疫组织化学染色
　　高倍镜下(10×40倍视野)Brdu免疫阳性细胞的细胞核呈棕黄色颗粒状，细胞计数显示，脑缺氧缺血组和脑缺氧缺血后电针组侧脑室的SVZ和齿状回Brdu免疫阳性细胞均较正常对照组增多，脑缺氧缺血后电针组侧脑室的SVZ和齿状回Brdu免疫阳性细胞较脑缺氧缺血组明显增多，两两比较差异均有统计学意义(P<0.05)（表2）。
　　
　　表2 各组动物齿状回Brdu免疫阳性细胞数变化(x±s)
　　组别 例数(只) 齿状回亚颗粒细胞层(个) F值P值
　　空白对照组 2310.22 ± 2.21
　　缺氧缺血组 2219.78 ± 2.86*178.24 0.000
　　缺氧缺血后电针组2424.04 ± 2.58▲
　　与空白对照组比较，*P<0.05，▲P<0.05；与缺氧缺血后电针组比较，▲ P<0.05
　　
　　3 讨论
　　百会穴位居颅顶部，其深方为脑；且百会属督脉经穴，督脉又归属于脑。可见，百会穴与脑密切联系，是调节大脑功能的要穴。大椎穴为督脉本经穴，泻之可清泻诸阳经之邪热盛实，通督解痉，补之灸之可通全身之阳，固卫安营。表明电针督脉“大椎”、“百会”穴可改善脑血流量，对缺血神经元损伤有保护作用[7,8]。本实验电针穴位选用督脉经穴，是基于中医学中的奇经对整个经络系统具有组合统率作用，督脉是人体诸阳经之总汇，其所属穴位主治适应证相当广泛，历代医家多有“病变在脑，首取督脉”之说[8]。
　　神经上皮干细胞蛋白(Nestin)是神经干细胞所表达的一种特异性标志物。在病理情况下，受损脑组织神经上皮干细胞蛋白(Nestin)表达水平，可作为监测神经干细胞发生水平的敏感性标志之一[9,10]。本研究显示，缺氧缺血组和缺氧缺血后电针组CA1区神经上皮干细胞蛋白(Nestin)免疫阳性细胞均较正常对照组增多，缺氧缺血后电针治疗组海马CA1区神经上皮干细胞蛋白(Nestin)免疫阳性细胞较缺氧缺血组明显增多，两两比较差异均有统计学意义(P<0.05)，提示电针刺激脑缺血缺氧大鼠 “百会”和“大椎”两穴位可激发脑内海马CA1区神经干细胞增殖。
　　Brdu(5-溴-2-脱氧脲嘧啶)是一种胸腺脱氧核苷类似物，在细胞的增殖周期S期即DNA合成期整合入细胞核DNA中，故Brdu是反映细胞增殖状态的理想标志物[11]。免疫荧光双染法显示，大多数Brdu免疫阳性细胞可同时拥有神经元特异标志物NeuN和成熟神经元特异标志物Calbindin-D28K，该共存现象提示Brdu免疫阳性细胞大多数分化为成熟神经元，因此，Brdu免疫阳性细胞的数目基本可代表脑内神经前体细胞的发生水平[12]。本研究中各组动物齿状回Brdu免疫阳性细胞计数显示，缺氧缺血组和缺氧缺血后电针治疗组均较正常对照组增多；缺氧缺血后电针治疗组较缺氧缺血组明显增多，两两比较差异均有统计学意义(P<0.05)，提示电针刺激脑缺血缺氧大鼠 “百会”和“大椎”两穴位可促进齿状回神经前体细胞增殖。
　　海马结构与学习、记忆和认知等关系密切，脑缺氧缺血后施加电针穴位治疗可进一步激发海马结构神经发生的水平，推测电针穴位治疗可在缺氧缺血性脑损伤时海马结构功能恢复中发挥重要作用。此结果为将电针穴位疗法用于防治缺氧缺血性脑损伤导致的患儿学习、记忆、认知和低能等功能的恢复提供实验依据。电针穴位治疗激发神经发生的机制尚待进一步研究。
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