BALF DNA倍体分析在周围型肺癌中的诊断价值
作者：杨力, 周琴, 张立波, 郭光云, 陈功, 邝军
【关键词】 肺癌;DNA倍体分析;细胞学
周围型肺癌是胸科常见病之一，虽然有各种X线征象，多肿瘤标志物等检查的支持，但却因无病诊断而无法确诊。支气管肺泡灌洗液行常规细胞学检查已开展多年，但由于常规细胞学检查时，光镜观察对细胞核形态只能作大致的描述，容易受到病理科医生主观因素的影响，常使其不敢下肯定性结论，致使其临床价值降低。细胞内DNA含量分析的出现,避免了主观因素的影响,为恶性肿瘤的诊断提供了一种较可靠的方法,并可弥补常规细胞学检查的不足[1]，现报告如下。
1 资料与方法
1.1 资料
2005年10月-2008年5月期间26例患者中，男性15例，女性11例；年龄49～83岁(平均65.3岁)。病变均位于段支气管开口以下肺野部位。上叶11例，下叶12例，中叶3例。术前或术后均经彩超或CT引导下穿刺活检确诊为肺癌。
仪器：OLYMPUS BF TYPE P30纤支镜,兰丁麦克奥迪全自动细胞DNA倍体分析系统。
1.2 检查方法
术前仔细阅读胸部X线片或胸部CT，找到肿瘤所在相应引流支气管，然后行支气管镜检查，先在引流支气管深部盲钳可能发生病变的支气管，然后用无菌生理盐水50～100 mL灌洗，收集灌洗液20～35 mL，送病理科行细胞内DNA含量分析及细胞学检查，每例灌洗液10～30 mL经离心后(2 500 r/min,10 min),加适量上清液后用细胞涂片离心机(武汉兰丁医学高科技有限公司)离心涂片,制成2张薄层细胞片。1～2张玻片做瑞氏染色供常规细胞学检查,另1～2 张玻片行经福尔根（Feulgen）DNA染色,用全自动细胞图像分析系统（AcCell）。
1.3 判断标准
常规细胞学诊断结果分为3 类:炎性细胞、核异质细胞和癌细胞。
DNA分析系统:所有Feulgen染色片用AcCell全自动细胞图像分析系统进行扫描处理。细胞片染色质量控制用HL 60细胞株片作对照。AcCell系统对每张玻片上6 000个以上的细胞核进行扫描测定。经扫描后的每个细胞核均有123个特征值，包括形态特征、吸光特征、具体结构特征、Markovian和非Markovian结构特征和长度特征等。AcCell系统根据不同细胞成分所具有的不同特征参数来完成自动细胞分类和计数过程，如正常上皮细胞，增生或癌变细胞，淋巴细胞，中性白细胞及未参与诊断的垃圾细胞（重叠细胞核，聚焦不良细胞核和核碎片等）。标准对照细胞为同张玻片上的100个正常上皮细胞，所测出的积分光密度(Intergrated Optical Density,IOD)为2C的值，其CV（Coefficient of Variation）值小于5%，DNA指数大于2.5的细胞进行核实，以排除垃圾和重叠的细胞核。
二倍体细胞(G1/G0) 的DNA指数(DNA Index,DI)为1,当DI=2时,多为四倍体细胞(G2/M期)[2]。 当＞15％细胞DI在1.1～1.9之间形成峰,即可诊断为DNA倍体异常细胞，有3个以上DI>2.5考虑癌细胞。
1.4 统计学处理
率的比较采用χ2检验,P＜0.05差异有显著性意义。
2 结果
2.1 细胞学检测结果
发现癌细胞7例，高度核异质及核异质细胞10例，余发现炎性细胞及红细胞。灌洗液常规细胞学检查总阳性率26.9%。
2.2 DNA倍体分析结果
DNA图像分析系统结果显示：6例均为DNA指数在0.9～1.2的细胞，7例有大量DI值在1.2～2.5倍体异常细胞，并形成峰，13例有DI值＞2.5的异倍体细胞。其中7例常规细胞学检查发现癌细胞者其DI值均＞2.5，DNA图像分析系统检测的阳性率为76.9%。
2.3 DNA倍体分析系统与常规细胞学诊断比较
常规细胞学阳性率为26.9%,DNA图像分析系统检测的阳性率为76.9%，两种方法的阳性率差异有显著性(χ2=11.01,P＜0.05)。
其中7例常规细胞学检查发现癌细胞者其DI值均＞2.5，另6例DI值均＞2.5及3例DI值分别为1.9、2.2、2.3者，当将DNA 定量检测的结果反馈给细胞病医生后，最终确定为癌细胞。两者结合阳性率61.5％，与单纯细胞学检查相比差异有显著性(χ2=7.12,P＜0.05)。
3 讨论
BALF检查已广泛用于肺疾病的诊断，特别是对某些周围型肺部肿块不能行肺穿刺或开胸活检者，BALF检查可直接取得肺局部病变之信息，故有学者将BALF检查称为“液相肺活检” 。但是细胞学检查的局限性仍使其作用受限,使很多周围型肺癌得不到确诊。
用DNA倍体分析系统进行子宫颈癌及癌前病变的诊断在国外已有大量报道[3]。国内学者孙小蓉等开展了相应工作[4]，但将这项检查运用于BALF却少有报导。
正常细胞及肿瘤细胞在生长增殖时,细胞核内DNA结构及含量都会发生变化。通过对细胞核内的DNA测定能了解正常细胞周期变化及发现恶性增殖的肿瘤细胞。DNA倍体分析系统是一种快速、简单的检测手段,能测定Feulgen法染色细胞核DNA含量,检测结果可以用简单直观的直方图表示,从制备样本到得到DNA的直方图一般只要20～30 min,同时还能检测细胞增殖周期。
本研究结果表明,DNA定量检测的阳性率(76.9%)，两者结合阳性率(61.5%)，均显著高于常规细胞病理(26.9%)，并具有统计学意义。7例常规细胞学检查发现癌细胞者其DI值均＞2.5，显示出高度一致性，当将DNA 定量检测的结果反馈给细胞病理学医生后，本组6例通过DNA倍体分析其DI值＞2.5，另有3例高度核异质细胞其DI值分别为1.9、2.2、2.3,并最终被确定为癌细胞。故两者结合起来可以让细胞病理学医师获得单纯从形态上难以得到的肿瘤生物学特征信息,为用形态学评估肿瘤生物学特征提供了有价值的补充,弥补细胞病理形态学诊断的不足，为其结论提供理论依据，从而提高细胞病理学阳性率，也有助于提高对形态学的认识水平[4]。
DNA倍体分析出现假阴性有4例,其原因可能为[5]:⑴肿瘤为二倍体肿瘤；⑵灌洗液中异倍体肿瘤细胞数量极少时,异倍体峰可能被正常的二倍体细胞所掩盖；⑶一些肿瘤细胞有染色体缺失, 但其复制可平衡,使肿瘤细胞净DNA倍体在DNA分析时正常。
在进行支气管肺泡灌洗（BAL）时，应仔细阅读胸片或CT片，找准所需支气管或亚段支气管，必要时行病理检查,以提高阳性检测率。
【】
[1]Saha I,Dey P,Vhora H,et al.Role of DNA flow cytometry and image cytometry on effusion fluid[J].Diagn Cytopathol,2000,22(2):81-85.[2]Osterheld MC,Liette C,Anca M.Image cytometry:an aid for cytological diagnosis of pleural effusions[J].Diagn Cytopathol,2005,32(3):173-176.[3]Grote HJ,Friedrichs N,Pomjanski N,et al.Prognostic significance of DNA cytometry in carcinoma of the uterine cervix FIGO Stage IB and II[J].Anal Cell Pathol,2001,23(3-4):97-105.[4]孙小蓉,汪 键,Alfred Boecking.DNA倍体分析系统用于宫颈癌及上皮内瘤变的诊断及预测[J].中华病理学杂志,2005,34(7):435-437.[5]冯加喜，陈葆国，林 云.胸液细胞DNA倍体分析和癌胚抗原测定在恶性胸液中诊断价值比较[J]．呼吸与危重监护杂志，2003,2（2）:77-78.
