利用同尾酶技术构建pET15b
[摘 要] 目的: 利用同尾酶技术构建pET15b-PEP-1-CAT重组质粒，为制备PEP-1-CAT融合蛋白进而为防治心肌缺血再灌注损伤奠定基础。方法:设计并合成两端分别带SalⅠ和BglⅡ酶切位点的CAT引物，用PCR方法以pZeoSV2(+)-CAT质粒为模板，特异性扩增CAT 全长cDNA。将扩增的CAT cDNA 与dATP 反应,利用Taq DNA聚合酶具有的非模板依赖性末端转移酶活性在CAT cDNA的3′末端加"A"并纯化，然后应用TA克隆策略将纯化后的CAT cDNA插入至中间载体pGEM-T Easy Vector中，经PCR、限制性酶切分析鉴定重组子pGEM-T-CAT。人工合成编码PEP-1的双链寡核苷酸，两端分别引入NdeⅠ和XhoⅠ酶切位点，将其插入pET15b中得到重组质粒pET15b-PEP-1，然后酶切鉴定。pGEM-T-CAT和pET15b-PEP-1分别经SalⅠ-BglⅡ和XhoⅠ-BamHⅠ双酶切，利用同尾酶（SalⅠ与XhoⅠ，BglⅡ与BamHⅠ）能酶切产生相同黏性末端的特性，将回收得到的CATcDNA片段与pET15b-PEP-1相连，构建出重组质粒pET15b-PEP-1-CAT，经PCR及酶切鉴定，并通过核苷酸序列测序证实。 结果: 获得pET15b-PEP-1-CAT重组子，经测序分析证实，克隆入pET15b的PEP-1序列与设计合成的PEP-1序列一致，CAT序列与GeneBank中登录号为“AY028632”的CAT cDNA序列一致。 结论: pET15b-PEP-1-CAT的成功构建为产生融合蛋白His tag-PEP -1-CAT进而为防治心肌缺血再灌注损伤奠定了基础。
[关键词] 同尾酶;过氧化氢酶;TA克隆;DNA重组;PEP-1肽
Abstract:Objective To construct the recombinant plasmid pET15b- PEP-1-CAT with isocaudamer technique and provide a vector expressing PEP-1-CAT fusion protein for the prevention and therapy of myocardial ischemia-reprefusion injury.Method Using pfu DNA polymerase,the full-length human catalase cDNA was specifically amplified via PCR from pZeoSV2(+)-CAT plasmid. The PCR product was added"A"by using the template-independent terminal transferase activity of Taq DNA polymerase. The purified products of CAT cDNA whose 3' end was added "A" were ligated with pGEM-T Easy vector ,and were transformed into DH5α. The correct recombinant was identified by PCR and SalⅠ-BglⅡ digestion and named after pGEM-T-CAT.Two oligoncleotides were synthesized and annealed to generate a double-stranded oligonucleotide encoding the PEP-1 peptide.The PEP-1 peptide sequence was directly ligated into NdeI-XhoI-digested pET15b.The recombinant plasmid was identified by double-enzyme digested and named after pET15b-PEP-1. pET15b-PEP-1 and pGEM-T-CAT were further digested by XhoI-BamHI and SalI-BglⅡ,respectively. The purified linear fragment of pET15b-PEP-1 and the purified CAT cDNA fragment were ligated by using two pairs of isocaudamers which have different recognition sequences but produce compatible cohesive ends. The plasmid with the expected insert was selected using a XhoI restriction analysis and then analysed by sequencing. Results The recombinant plasmid was confirmed that the PEP-1 and the human CAT cDNA sequence of pET15b- PEP-1-CAT by sequencing were consistent with designed PEP-1 peptide and the human catalase cDNA sequence of GeneBank"AY028632", respectively. The pET15b-PEP-1-CAT of prokaryotic expression plasmid was constructed successfully. Conclusion Construction of pET15b-PEP-1-CAT recombinant plasmid provides a basis for production of His tag-PEP-1-CAT fusion protein to prevent and treat myocardial ischemia reperfusion injury.
Key Words:Isocaudamer； catalase；TA-cloning；DNA recombination；PEP-1 peptide
目前已有相当多的证据表明，活性氧（包括・O2-,・OH,H2O2等 ）介导多种疾病发生的病理生理过程。细胞防御体系利用抗氧化酶如超氧化物歧化酶(SOD)、过氧化氢酶(CAT)、谷胱甘肽过氧化物酶(GPX)来对抗活性氧。SOD催化・O2-分解产生H2O2,而CAT和GPX则将H2O2降解为H2O和O2,并避免・OH基团的产生。尽管长期以来人们希望将过氧化氢酶应用于防治各种氧化应激损伤，但由于缺乏有效的导入细胞的方法而限制了其生物学效应的发挥。
为了使自胞外途径加入的CAT能够有效的清除胞内活性氧，我们构建了pET15b-PEP-1-CAT重组质粒，以便它在基因工程菌中表达产生可穿透细胞的重组过氧化氢酶蛋白PEP-1-CAT。在构建过程中，我们设计合成CAT的引物，其上游引物5′端引入SalⅠ位点、下游引物3′端引入BglⅡ位点，而SalⅠ与XhoⅠ、BglⅡ与BamHⅠ互为两组同尾酶，利用两组同尾酶切割后能产生相同粘性末端并能通过碱基互补作用彼此连接的特性，将CAT cDNA片段插入到pET15b-PEP-1上，从而成功构建了pET15b-PEP-1-CAT重组质粒。
1 材料和方法
1．1材料
1．1．1主要仪器:PCR仪（Biometra，德国）、透射式紫外分析仪（EF-90A,上海）、凝胶成像系统（Touching 955 gel Document System,上海）、台式高速离心机（Hettich Universal 32R,德国）
1．1．2主要试剂:Taq DNA聚合酶、dNTP、dATP、T4 DNA连接酶购自Promega公司，Pfu酶为New England Biolabs公司产品，限制性内切核酸酶XhoⅠ、BamHⅠ、NdeⅠ、XbaⅠ购自北京赛百盛基因技术有限公司，SalⅠ、BglⅡ购自晶美生物工程有限公司，DNA分子量标准（Marker）为北京华美生物工程有限公司产品。PCR引物及PEP-1的寡核苷酸链由赛百盛公司合成。
1．1．3质粒与菌株:模板质粒pZeoSV2(+)-CAT由美国西奈山医学院生化/药系白景香博士惠赠；质粒pET15b购自Novagen公司；pGEM-T Easy载体系统为Promega公司产品；大肠杆菌DH5α为本室保存。
1．2方法
1．2．1 pET15b-PEP-1-CAT构建流程图（图1）
1．2．2 PCR扩增目的片段:根据GeneBank中登录号为“AY028632”的人CAT cDNA设计合成CAT的引物，两端分别直接引入SalⅠ、BglⅡ酶切位点：上游引物：5′SalⅠ GTCGACATG GCT GAC AGC CGG GAT CCC GCC 3′（30 bp）,下游引物：5′BglⅡAGA TCTTCA CAG ATT TGC CTT CTC CCTTGC3′（30 bp）以pZeoSV2(+)-CAT为模板，PCR扩增两端分别带有SalⅠ和BglⅡ酶切位点的CAT片段。PCR反应体系：10×buffer(含MgSO4)10 μl、10×dNTP 10 μl（2 μmol/L）、上下游引物各10 μl、Pfu酶4 μl、模板2 μl，补加去离子水至总体积100 μl。循环参数：94 ℃预变性5 min，94 ℃变性30 s，60 ℃退火30 s，72 ℃延伸2 min，30个循环后72 ℃延伸10 min。取10 μlPCR产物行1.0%琼脂糖凝胶电泳鉴定，结果得到一条约1 600 bp的片段。将剩余PCR产物用NH4Ac沉淀法进行纯化回收。
1．2．3 CAT cDNA片段两3′端加"A":在纯化得到的PCR产物沉淀中，加入高压三蒸水34 μl、10×buffer 5 μl、10×MgCl2 5 μl、2Mm dATP 5 μl、Taq酶1 μl，总反应体系50 μl。PCR仪上70 ℃ 30 min后，0.8％低熔点琼脂糖凝胶电泳回收加“A”后的CAT cDNA片段。
1．2．4 T载体克隆:将上步中回收所得片段，按pGEM-T EasyVector说明书进行T载体克隆。配制连接体系：将上步中所得3′加A的CAT沉淀以3 μl高压三蒸水溶解，2×Rapid ligation buffer 5 μl, pGEM-T 载体1 μl，T4 DNA连接酶1 μl,总体系为10 μl，4 ℃连接过夜。连接产物转化感受态大肠杆菌DH5α，将转化的大肠杆菌液涂布于含X-gal(20 mg/ml)、IPTG(24 mg/ml)、Ampicillin(100 mg/ml)的固体LB培养板上，以蓝白筛选法筛选阳性克隆。经PCR及SalⅠ-BglⅡ双酶切鉴定，阳性重组子命名为“pGEM-T-CAT”，－20 ℃保存备用。
1．2．5 pET15b-PEP-1重组质粒的构建:人工合成编码PEP-1的序列。Top strand：5′NdeⅠTAT GAA AGA AAC CTG GTG GGA AAC CTG GTG GAC CGA ATG GTC TCA GCC GAA AAA AAA ACG TAA AGT GC 3'（68 bp）Bottom strand：5′xhoⅠTCG AGC ACT TTA CGT TTT TTT TTC GGC TGA GAC CAT TCG GTC CAC CAG GTT TCC CAC CAG GTT TCT TTC A 3′（70 bp）将人工合成的编码PEP-1的两条单链寡核苷酸煮沸复性为双链PEP-1。pET15b用XhoⅠ-NdeⅠ双酶切后回收大片段，然后将两者相连，反应体系：pET15b（沉淀）、PEP-14 μl、2×Rapid ligation buffer 5 μl、T4 DNA连接酶1 μl，总体系为10 μl，4 ℃连接过夜。连接产物转化DH5α后，随机挑取单菌落培养，碱裂解法提取质粒DNA，经XhoⅠ-XbaI双酶切鉴定。因pET15b上带有一个XbaI的酶切位点，因此重组质粒采用XhoⅠ-XbaⅠ双酶切电泳，切下含有PEP-1的片段应为167 bp,不含PEP-1的片段为104 bp,鉴定正确的重组质粒命名为"pET15b-PEP-1"，－20 ℃保存备用。
1．2．6 pET15b-PEP-1-CAT重组质粒的构建:首先用XhoⅠ-BamHⅠ对pET15b-PEP-1进行双酶切后回收大片段，再用SalⅠ-BglⅡ消化pGEM-T-CAT回收1 600 bp的CAT片段。XhoⅠ与SalⅠ,BamHⅠ与BglⅡ互为两组同尾酶，利用同尾酶酶切后能产生相同黏性末端的特性进行片段的连接。将连接产物转化大肠杆菌DH5α后铺板，37 ℃温箱孵育。挑取单菌落小量培养后，经PCR及XhoⅠ单酶切鉴定。因为通过同尾酶技术连接后原有酶切位点均被破坏，pET15b上的XhoⅠ位点不存在了，而CAT cDNA上有一个XhoⅠ的位点，因此用XhoⅠ单酶切鉴定，如切出一条7 365 bp的片段则重组正确。命名为“pET15b-PEP-1-CAT”。
1．2．7 pET15b-PEP-1-CAT序列测定:取10 μl pET15b-PEP-1-CAT，加10 μl高压三蒸水稀释后寄往北京华大中生科技有限公司进行核苷酸序列测定。
2 结果
2．1 编码人CAT cDNA的PCR扩增
以pZeoSV2(+)-CAT质粒为模板，经CAT上下游引物PCR后，行1.0%普通琼脂糖凝胶电泳，可见扩增出1600 bp的CAT片段(图2)。
图2 pZeoSV2(+)-CAT质粒的PCR 产物（略）
Fig 2 PCR amplification of the full length coding region of CAT from pZeoSV2(+)-CAT plasmid
Marker:200 bp DNA Ladder；1:PCR product（1 600 bp）
2．2T载体克隆
用NH4AC沉淀法对PCR扩增的CATcDNA进行纯化，利用Taq酶的非模板依赖性末端转移酶活性，在PCR产物的3′末端加单个脱腺苷酸（A），纯化后将其直接克隆入3′末端带T的中间载体pGEM-T-Easy vector上，连接产物转化DH5α，经Amp抗性和蓝白显色筛选，见培养板上长出蓝白斑比例约为1∶2，总菌落数约32个。挑取白色单菌落接种扩增后提取质粒，经SalⅠ-BglⅡ双酶切鉴定，发现有1600 bp的条带（图3），阳性克隆命名为“pGEM-T-CAT”。
图3 pGEM-T-CAT 的SalⅠ-BglⅡ双酶切鉴定（略）
Fig 3 Identification of pGEM-T-CAT digested with SalⅠ and BglⅡ
Marker:200bp DNA Ladder；1:Identification of pGEMTCAT digested with SalⅠ and BglⅡ(1 600 bp,3 000 bp)
2．3 pET15b-PEP-1重组质粒的构建
首先将人工合成的编码PEP-1的两条单链寡核苷酸用煮沸法复性为双链DNA，质粒pET15b用XhoⅠ-NdeⅠ双酶切后行0.8%低熔点琼脂糖凝胶电泳回收线性大片段。然后将带XhoⅠ、NdeⅠ黏性末端的PEP-1双链克隆至pET15b中，连接产物转化DH5α，提取质粒后经XhoⅠ-XbaⅠ双酶切鉴定，见一167 bp的片段（图4），命名为“pET15b-PEP-1”。
图4 pET15bPEP1重组质粒用XhoⅠXbaⅠ双酶切鉴定（略）
Fig 4 Identification of pET15b-PEP-1 digested with XhoⅠ and XbaⅠ
Marker:100bp DNA Ladder；2:pET15b-PEP1/ XhoⅠ + XbaⅠ (167 bp, 5 604 bp)；1、3:pET15b/XhoⅠ + XbaⅠ(104 bp,5 604 bp)
2. 4 pET15b-PEP-1-CAT重组质粒的构建
质粒pET15b-PEP-1用XhoⅠ-BamHⅠ双酶切后行0.8%低熔点琼脂糖凝胶电泳回收约5 766 bp的大片段，pGEM-T-CAT用SalⅠ-BglⅡ双酶切后行1.0%低熔点琼脂糖凝胶电泳回收约1 600 bp的片段。利用两组同尾酶（SalⅠ与XhoⅠ、BglⅡ与BamHⅠ）能酶切产生相同黏性末端的特性，进行DNA片段的连接，转化DH5α，提取质粒后经XhoⅠ单酶切鉴定，可见约7 365 bp的条带（图5），命名为"pET15b-PEP-1-CAT"。
图5 pET15bPEP1CAT 重组质粒用XhoⅠ单酶切鉴定（略）
Fig 5 Identification of pET15bPEP1CAT digested with XhoⅠ
Marker:λDNA/HindⅢ Marker；1:pET15bPEP1CAT/XhoⅠ (7 365 bp)
2. 5 pET15b-PEP-1-CAT的核苷酸序列测定
将经上述限制性酶切分析、电泳鉴定有目的片段插入的纯化质粒，寄往北京华大中生科技有限公司进行核苷酸序列测定。分析证实：PEP-1编码区和CAT cDNA 编码区均成功地克隆入了pET15b质粒，而且其序列分别与设计合成的PEP-1序列和GeneBank中登录号为“AY028632”的人CAT cDNA序列完全一致(图6)。
3 讨论
过氧化氢酶（Catalase,CAT）是机体抗氧化防御系统的重要组成部分，可通过清除体内的氧自由基而发挥其对抗氧化应激的作用，因此，应用抗氧化酶来防治氧自由基介导的疾病已引起了医学界的广泛关注[1]。目前认为，基因是实现将外源基因导入细胞内表达治疗性蛋白的一种很有前途的方法，但基因治疗存在一些关键问题尚未解决，包括基因导入效率、基因表达的可控性、有效性、安全性等[2]。近年来，细胞穿透肽的发现为这一难题的解决提供了突破口。
细胞穿透肽（Cell Penetrating Peptides,CPPs）,是一种能携带多种大分子物质高效穿透生物膜的结构。CPPs作为一种很有前途的运载工具，已经得到了广泛关注，其中研究最多的是Tat。许多报道[3~6]，Tat-GFP、Tat-GDH、Tat-SOD、Tat-CAT融合蛋白均能被有效转导入哺乳动物细胞，并穿透动物皮肤。进一步研究发现，转导的Tat-SOD、Tat-CAT能增加百草枯（一种可产生超氧阴离子的外源性物质）处理过的哺乳动物细胞的存活力，这就表明这些融合蛋白有对抗氧应激的作用。但Tat等界存在的CPPs作为一种运载工具具有很多优点，但同时也存在缺憾，如需要将融合蛋白变性才能使其进入细胞，融合蛋白进入细胞后需要分子伴侣将其重折叠为有活性的天然构象，因此其活性的发挥有赖于重折叠效率。此外，关于其是否有细胞毒性和免疫遗传性等问题尚存在争议。因此，为了提高被转导的蛋白在细胞内的生物学活性，就需要设计一种可将目的蛋白以天然活性形式导入细胞内的新型载体。Morris小组[7]设计合成了一个含21个氨基酸的肽段载体PEP-1,它由三个结构域构成：一个富含色氨酸的疏水区(KETWWETWWTEW)；一个连接区(SQP)；一个富含赖氨酸的亲水区(KKKRKV)。此载体具有很多自然界存在的CPPs所无法比拟的优势：能携带多种肽段和蛋白质以天然活性形式进入多种细胞系，而不需要任何化学的共价结合或变性步骤；在生理缓冲液中具有高度的稳定性；安全无毒性；不受血清影响等。
本研究通过基因工程手段构建出pET15b-PEP-1-CAT原核表达质粒。常规方法是在目的基因片段的两端引入与载体酶切位点相同的黏性末端来克隆PCR扩增片段，从而通过粘性末端连接的方案将目的片段克隆入载体。我们根据pET15b有NdeⅠ和XhoⅠ的酶切位点，而PEP-1的编码序列中不含这两个位点，因此在其正义链的5′端加入NdeⅠ、反义链的5′端加入XhoⅠ的位点，从而保证了PEP-1的编码序列正向插入到pET15b中。但在将CAT cDNA插入到pET15b-PEP-1时，用同样的策略就遇到了困难，因为pET15b有XhoⅠ和BamHⅠ的位点，而CAT的基因序列中有1个XhoⅠ和3个BamHⅠ的位点，这样就不能保证CAT cDNA在需要的位置被XhoⅠ和BamHⅠ正确切开。常规的方法是采用部分酶切，通过做预试验、改变酶切时间、温度及酶浓度等反应条件而找到不足以把所有的酶切位点都切断的最适反应体系，然后进行大量酶切，但这一方法繁琐、费时。林澄涛等[8]在疟疾多价重组DNA疫苗的构建中曾应用同尾酶技术，在所有组合片段的两侧分别加上一组同尾酶，将不同的抗原表位加以灵活重组，从而构建了不同组合形式的疟疾多价重组DNA疫苗。因此我们在重组过程中也借鉴了这一思路。我们设计合成CAT的引物，其上游引物5′端引入SalⅠ位点、下游引物3′端引入BglⅡ位点，而SalⅠ与XhoⅠ、BglⅡ与BamHⅠ互为两组同尾酶，利用两组同尾酶切割后能产生相同粘性末端并能通过互补作用彼此连接的特性，将CAT cDNA片段成功地插入到pET15b-PEP-1上。另外，传统的粘性末端克隆法可能会遇到一定的技术困难，原因之一就是许多限制性内切酶不能正确切割位于DNA末端的识别位点，这些酶包括HindⅢ、SalⅠ、XbaI、XhoⅠ、NotⅠ等，它们已被证明用于酶切位于DNA片段末端与次末端时识别效率不高[9]，因此不能保证在连接前PCR片段是被完全切开的。丁鹏等[10]和董晓等[11]采用高保真的pfu DNA聚合酶，然后对PCR产物进行纯化，利用Taq酶在其3′末端加单个不配对“A”的特性，分别成功的利用TA克隆构建了pET15b-SOD1和PET15b-EGFP重组质粒。我们在重组中也采用了这一方案。
本研究成功构建了原核表达质粒pET15b-PEP-1-CAT，为其在基因工程菌中表达产生融合蛋白His tag-PEP-1-CAT进而用于心肌缺血再灌注损伤的治疗提供了高效的特异性表达目的基因的载体。
（文中图1、6见封二）（略）
[文献]
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