体外连接法快速高效构建表达β-半乳糖苷酶的重组腺病毒载体

                  作者：王家宁, 王传成 郭凌郧, 黄永章

  [摘  要]  目的: 采用体外连接法构建和制备重组腺病毒Adeno-X-LacZ，为构建具有价值的重组腺病毒载体奠定基础。 方法: PI-Sce Ⅰ/I-Ceu Ⅰ酶切pShuttle2-LacZ穿梭质粒，回收4.6 kb的LacZ基因表达盒，与经过相同酶切的Adeno-X病毒DNA连接，连接产物用SwaⅠ酶切，最终产物转化DH5α。重组质粒用PCR法和PI-Sce Ⅰ/I-Ceu Ⅰ酶切鉴定。pAdeno-X-LacZ用PacⅠ线性化后，用脂质体介导其转染至AD293细胞内包装扩增出重组腺病毒颗粒，采用CsCl密度梯度离心法纯化重组腺病毒Adeno-X-LacZ。采用X-gal染色观察Adeno-X-LacZ在AD293细胞内包装和HVSMC表达情况。 结果: PCR扩增可见312 bp特异性条带，PI-Sce Ⅰ/I-Ceu Ⅰ酶切重组质粒后释放出4.6 kb LacZ基因表达盒。X-gal染色证实了在AD293细胞内成功扩增包装出重组腺病毒Adeno-X-LacZ和LacZ基因在HVSMC中得到有效表达。 结论: 体外连接法是一种快速、简便、高效的构建重组腺病毒质粒的方法，本研究为构建具有治疗价值的重组腺病毒奠定了基础，Adeno-X-LacZ为研究腺病毒介导的基因转移提供了一良好的对照载体。

    [关键词]  体外连接;腺病毒;β－半乳糖苷酶;PI-SceⅠ;I-CeuⅠ

    Abstract:  Objective To construct recombinant adenoviral vector expressing β-galactosidase by in vitro ligation and provide a basis for construction of recombinant adenovirus vector expressing therapeutic gene of interest.Methods pShuttle2-LacZ was digested with PI-Sce Ⅰ/I-Ceu Ⅰand 4.6 Kb fragment of LacZ gene expression cassette was recovered .This fragment was ligated to predigested Adeno-X viral DNA with PI-Sce Ⅰ/I-Ceu Ⅰ. The ligated product was digested with Swa Ⅰ.The resultant DNA was transformed into E. Coli. DH5α.The correct recombinant plasmid, pAdeno-X-LacZ ,was identified by PCR and PI-Sce Ⅰ/I-Ceu Ⅰdigestion. The Pac I-digested, linearized pAdeno-X-LacZ was transfected into AD293 cells by Lipofectamine. Recombinant adenovirus , Adeno-X-LacZ, was purified with CsCl density gradient ultracentrifugation. HVSMC was infected with Adeno-X-LacZ. X-gal staining was performed to monitor the expression of β-galactosidase gene. Results There was a specific band of 312bp when pAdeno-X-LacZ was amplified by PCR. PI-SceⅠ/I-CeuⅠdigestion of pAdeno-X-LacZ released 4.6Kb of LacZ gene fragment. X-gal staining confirmed Adeno-X-LacZ was packaged successfully within AD293 cells and the expression of β-galactosidase gene in HVSMC. Conclusion In vitro ligation is a simple, rapid and efficient method for constructing recombinant adenoviral vector. This study provides a basis for construction of recombinant adenoviral vector carrying therapeutic gene of interest, Adeno-X-LacZ is also a useful control vector for the research of gene transfer mediated by recombinant adenovirus.

    Key words: In vitro ligation; Adenovirus; β-galactosidase; PI-Sce Ⅰ; I-Ceu Ⅰ

　 重组腺病毒载体具有转染效率高，感染细胞范围广，病毒滴度高，可感染细胞周期中静止期和分裂期细胞，同时可高效介导基因的体内外转移。因而腺病毒载体是目前后基因组时代基因功能研究和基因治疗研究普遍运用的载体[1-6]。但腺病毒载体的构建是一项费时费力具有挑战性的工作。过去细胞内同源重组方法构建和制备携带目的基因的重组腺病毒，由于同源重组率低和需要对重组体进行多轮费时费力的筛选鉴定，限制了重组腺病毒载体在研究中的应用[7-8]。细菌内同源重组法构建和制备重组腺病毒，由于操作相对复杂以及需要两种特殊的大肠杆菌（BJ5183, XL10-gold），使得构建重组腺病毒的效率相对低下[9-13]。本研究介绍体外连接方法构建和制备表达β－半乳糖苷酶的重组腺病毒载体，为构建重组腺病毒载体建立一新的技术平台，为构建携带目的基因的重组腺病毒载体奠定基础。

    1  材料和方法

    1.1  主要材料BD Adeno-X Expression system（购自BD Biosciences Clontech公司）包括Adeno-X Viral DNA(PI-Sce Ⅰ/I-Ceu Ⅰ已消化)，pShuttle2穿梭质粒（含有多克隆位点及PI-Sce Ⅰ/I-Ceu Ⅰ酶切位点），pShuttle2-LacZ,PI-Sce Ⅰ和I-Ceu Ⅰ内切酶，Adeno-X扩增引物(Forward primer:5’-TAGTGTGGCGGAAGTGTGATGTTGC-3’; Reverse primer: 5’-TCGACCATAGGGGATCGGGAGATC-3’)。X-gal（Sigma公司产品），Lipofectamine 2000（Invitrogen公司产品），λDNA/HindⅢ marker(华美生物工程公司产品)，DH5α为本研究所保存，SwaⅠ（New England Biolabs公司产品）。LigaFast Rapid DNA ligation sysrem（Promega公司产品）。AD293细胞（Stratagene公司）。

    1.2  主要仪器高速冷冻离心机（Hettich,Universal 32R，德国），超速冷冻离心机（Hitach，CP80MX，日本），紫外/可见光分光光度计（Cecil，CE2041，英国），倒置相差显微镜（Nikon，TE2000-U，日本），二氧化碳培养箱（Binder，德国），超净工作台（苏净集团安泰公司），超低温冰箱（-80   ℃，Sanyo，日本），凝胶图像分析系统（Touching 995 gel document system，天呈科技公司）。

    1.3  构建策略见图1。

    1.4  携带LacZ基因的重组腺病毒质粒pAdeno-X-LacZ的构建pShuttle2-LacZ用PI-Sce Ⅰ/I-Ceu Ⅰ酶切后进行低熔点琼脂糖凝胶电泳，回收4.6 kb含LacZ基因的表达盒。将回收片段与预先用PI-Sce Ⅰ/I-Ceu酶切的Adeno-X Viral DNA采用快速连接体系连接。将连接产物用Swa Ⅰ酶切，以去除腺病毒骨架质粒自身环化和酶切不完全所引起不携带LacZ基因片段的质粒。将Swa Ⅰ酶切后的产物用酚/氯仿抽提，纯化连接产物。将纯化后的连接产物转化感受态DH5α，将其铺于含氨苄青霉素（100 μg/ml）的LB平板上37 ℃倒置培养24 h。挑选菌落扩增，采用碱裂解法小量抽提质粒，用PCR方法和PI-Sce Ⅰ/I-Ceu Ⅰ酶切鉴定重组质粒是否携带有LacZ基因表达盒。若携带有LacZ基因表达盒的重组腺病毒质粒采用PCR扩增后则出现一特异性312 bp片段，采用PI-Sce Ⅰ/I-Ceu Ⅰ双酶切后会出现一4.6 kb的片段。

    1.5  Lipofectamine 2000介导pAdeno-X-LacZ转染AD293细胞取20 μg pAdeno-X-LacZ用Pac酶切37 ℃过夜，采用酚/氯仿抽提酶切片段，乙醇沉淀，高压三蒸水溶解，加50 μl Lipofectamine 2000脂质体，室温30 min，置4 ℃保存备用。AD293细胞培养于25 cm2塑料培养瓶，待60％融合时，进行转染。弃培养液，用PBS洗1次，加4 ml 10％FCS.DMEM培养液，加入预先准备好的DNA/脂质体复合物至培养瓶中，每3 d换培养液1次，观察细胞病变情况，至AD293细胞80％出现病变时收集细胞，37 ℃/-80 ℃反复冻融3次，12 000 g离心10 min，收集上清。

    1.6  重组腺病毒的扩增、纯化及滴度测定[14]取原代重组腺病毒上清，反复感染AD293细胞，37 ℃ 5％ CO2培养箱中培养，镜下观察到出现95％~100％病变时，收集细胞，以5 000 g离心，弃上清，沉淀重悬于适量PBS中，在37 ℃/-80 ℃反复冻融3次，以12 000 g离心收集上清，按照方法对重组腺病毒上清进行CsCl密度梯度离心纯化[14]，并将纯化后的腺病毒在透析液中（10 mmol/L Tris・HCl，1 mmol/L MgCl2，10%甘油）4 ℃透析2次，每次24    h。将透析后的病毒分装于1.5 ml离心管中，并进行滴度测定。取纯化后的病毒100 μl，10％SDS 20 μl，PBS 880 μl，混匀，测定病毒基因组DNA的OD260和OD280，据此病毒的颗粒数和纯度，1OD260＝1012 pfu/ml，pfu/ml＝OD260×dilution×1012，OD260/OD280＞1.3表示病毒纯度较高。

    1.7  人血管平滑肌细胞(Human vascular smooth muscle cells, HVSMC)培养组织贴块法培养,方法[15]。

    1.8  Adeno-X-LacZ重组腺病毒感染AD293细胞和HVSMC为观察原代Adeno-X-LacZ上清感染AD293细胞后的病毒扩增情况，病毒上清感染AD293细胞48 h后进行X-gal染色，为观察Adeno-X-LacZ在HVSMC中的表达，HVSMC待生长至80％融合时，按100∶1感染复数（multiplicity of infection，Moi）感染HVSMC。感染后置于37 ℃，5％CO2培养箱中培养48 h，进行X-gal染色。

    1.9  X-gal染色[16]Adeno-X-LacZ感染的细胞培养48 h后，弃去培养液，用PBS洗1次，加入0.05％戊二醛室温固定10 min，PBS洗3次，第二次保留10 min，加入含1 mg/ml X-gal染色液（2 mM MgCl2，35 mM K3［Fe(CN)6］，35 mM K4［Fe(CN)6］， 0.02％NP40， 0.01％脱氧胆酸）。置37 ℃ CO2培养箱中孵育2 h观察结果。

    2  结果

    2.1  pAdeno-X-LacZ的PCR鉴定结果BD Adeno Expression system试剂盒中提供的前向引物与腺病毒骨架DNA Adeno-X viral DNA的序列退火，而反向引物则与携带LacZ基因表达盒的序列退火。因而不含LacZ基因表达盒的腺病毒质粒，由于缺乏与反向引物退火所需要的表达盒序列，PCR扩增不出预期的312 bp的片段（图2）。

    2.2  pAdeno-X-LacZ的PI-Sce Ⅰ/I-Ceu Ⅰ酶切鉴定结果（图4）将提取的重组质粒经过PI-Sce Ⅰ/I-Ceu Ⅰ双酶切后，出现了一4.6 kb的LacZ基因表达盒片段，进一步证明成功地构建了pAdeno-X-LacZ重组质粒。

    2.3  Adeno-X-LacZ重组腺病毒上清感染AD293细胞的X-gal染色（图5）为了证明原代提取的病毒能感染AD293细胞，在原代病毒上清感染AD293细胞后第48 h进行X-gal染色，结果显示所有的AD293细胞均被蓝染，说明Adeno-X-LacZ在AD293细胞中得到了大量扩增并有效表达。

    2.4  Adeno-X-LacZ病毒滴度的测定结果重组腺病毒经包装、扩增、纯化后经紫外分光光度计测定，病毒滴度为3.8×1012 pfu/ml，OD260/OD280＝1.426＞1.3，说明病毒滴度较高，可满足在体基因的需要，且纯度较高。

    2.5  Adeno-X-LacZ感染HVSMC后的X-gal染色（图6）为了证明Adeno-X-LacZ在HVSMC中的表达情况，在以100 Moi感染HVSMC 48 h后进行细胞固定和X-gal染色，结果显示所有的HVSMC均被蓝染，说明Adeno-X-LacZ的感染效率较高，且LacZ基因在HVSMC中得到了高效表达。

    3  讨论腺病毒是双股DNA病毒。用于基因转移的腺病毒载体是缺乏E1区和E3区基因的复制缺陷性人血清型5型腺病毒。腺病毒基因组DNA全长为36 kb。由于基因组片段太大，难以找到特异有用的限制性内切酶酶切位点供体外连接使用。所以长期以来腺病毒载体的构建采用同源重组法包括细胞内同源重组和细菌内同源重组[7-13]。细胞内同源重组法是将腺病毒骨架质粒和携带目的基因的穿梭质粒共转染293细胞，这一方法要求两种质粒同时转移至同一293细胞中，并在该细胞中发生同源重组[7-8]。由于两种质粒转染同一293细胞的可能性很小，发生同源重组的几率就更小。另外细胞内同源重组法需要对病毒蚀斑进行多轮筛选，延长了实验周期。采用细菌内同源重组法构建重组腺病毒，需要两种特殊的大肠杆菌BJ5183和XL10-gold。由于BJ5183具有很强的重组酶活性，可使共转染的腺病毒骨架质粒和穿梭质粒发生同源重组，但为了提高重组质粒的稳定性，需将其转化至内切酶缺陷和重组酶缺陷的大肠杆菌XL10-gold中扩增，因而增加了操作的复杂性[9-13]。本研究采用Clontech公司提供的腺病毒体外连接体系成功构建了重组腺病毒质粒pAdeno-X-LacZ。采用体外连接法构建重组腺病毒质粒具有以下优点：①方法简便：该体系包括一个小的穿梭质粒pShuttle2，用于克隆目的基因。本研究使用的pShuttle2-LacZ重组穿梭质粒，是将LacZ基因片段克隆于pShuttle2的Xba Ⅰ-Not Ⅰ位点。穿梭质粒含有极罕见的两种内切酶酶切位点PI-SceⅠ和I-CeuⅠ,分别位于表达盒的两端。构建重组腺病毒时，只需将插入了外源基因的穿梭质粒用PI-Sce Ⅰ/I-Ceu Ⅰ双酶切后与经过同样酶切的腺病毒骨架质粒DNA连接。将连接产物用SwaⅠ酶切将可以去除自身连接和未线性化的腺病毒DNA。将最终产物转化DH5α，对提取的质粒用PCR方法和PI-Sce Ⅰ/I-Ceu Ⅰ酶切方法鉴定重组质粒的正确与否。本研究采用PCR扩增后可见312 bp条带，PI-Sce Ⅰ/I-Ceu Ⅰ酶切后出现4.6 kb的条带，说明pAdeno-X-LacZ的正确性。②节省时间：采用该体系构建的重组腺病毒质粒只需经Pac Ⅰ酶切后转染293细胞，在4~7 d内获得重组腺病毒。传统的细胞内同源重组法构建重组腺病毒由于所需时间较长，而293细胞在培养一周后开始脱落，为防止293细胞脱落和病毒蚀斑融合，需进行低熔点琼脂糖覆盖（Agarose Overlay procedure）。而采用体外连接法构建重组腺病毒在细胞尚未脱落之前，即可获得均一的重组腺病毒，而无需进行琼脂糖覆盖。③无需蚀斑筛选：该体系最大限度地减少了非重组腺病毒的产生和避免了费时费力的病毒蚀斑的筛选。因非线性化的腺病毒DNA和再连接的腺病毒DNA可用Swa Ⅰ酶切去除，大大降低了连接产物转化大肠杆菌后的背景。由于转染293细胞的重组腺病毒质粒已事先用PCR和酶切鉴定，故由293产生的重组腺病毒仅是含有目的基因的重组腺病毒，不会出现不含目的基因的重组腺病毒，因而无需蚀斑筛选。本研究采用体外连接法成功地构建了pAdeno-X-LacZ，将其转染AD293细胞后产生了重组腺病毒Adeno-X-LacZ。将其感染HVSMC后LacZ基因得到了高效表达。本研究为构建和制备重组腺病毒建立了一新的技术平台，为构建携带目的基因的重组腺病毒奠定了基础，同时也为腺病毒载体介导的基因转移的研究提供了一良好的对照载体。

       [参  考  文  献]

  　  [1]     张珊文,肖绍文,刘长清,等.重组人p53腺病毒注射液联合放射线治疗头颈鳞癌的Ⅱ期临床试验[J].中华医学杂志,2003,83(23):2 023-2 028.   

　  [2]     韩德民,黄志刚,张伟,等.重组人p53腺病毒注射治疗喉癌的Ⅰ期临床试验及追踪观察[J].中华医学杂志,2003,83(23):2 029-2 032.

     [3]     解先宽,杨迪生,叶招明,等.反义c-myc对增强顺铂引起骨肉瘤细胞凋亡作用的实验研究[J].病理生理杂志,2005(7):1 326-1 330.  

  　 [4]     陈祖兵,陶剑平,梁力建,等.腺病毒介导的T-bet基因转染诱导Th1型淋巴细胞分化[J].中国病理生理杂志,2005(6):1 167-1 170.    

　 [5]     罗  燕,唐仕波,李湘,等.细菌内同源重组高效制备含绿色荧光蛋白和抗凋亡基因bcl-XL的重组腺病毒载体[J].中国病理生理杂志，2002,18(12): 1 462-1 467.  

   [6]     葛永贵,王家宁,张群林,等.经皮冠脉内腺病毒载体介导的血管内皮生长因子基因转移治疗严重冠心病[J].郧阳医学院学报,2000,19(4):197-201.   

　  [7]     王家宁,黄永章,王俊峰,等.重组β-半乳糖苷酶腺病毒载体的构建及其在血管平滑肌细胞中的表达[J]. 郧阳医学院学报,2000,19(4):193-196. 

　    [8]     王家宁,黄永章,王俊峰,等.反义VEGF165腺病毒重组体的构建及鉴定[J].郧阳医学院学报,2001,20(1):1-4.  

　   [9]     He TC, Zhou S, Da Costa LT, et al. A simplified system for generating recombinant adenoviruses[J].Proc Nvatl Acad Sci USA,1998,95(5):2 509-2 514.   

　  [10]     王家宁,黄永章,孔  霞,等.细菌内同源重组快速构建和制备表达β-半乳糖苷酶的重组腺病毒[J]. 郧阳医学院学报,2004,23(1):1-5.   

　  [11]     孙跃玲,王家宁,涂远超,等.菌体内同源重组构建pAdEasy-1-Cat重组体[J].郧阳医学院学报,2003,22(4):193-196.   

　  [12]     陈  ,徐少勇,邓长生,等.菌体内同源重组构建pAdEasy-1/hp27mt腺病毒质粒[J].郧阳医学院学报,2003,22(2):65-69.    

　 [13]     李红乐,秦清和,王静珍,等.应用细菌同源重组法快速构建和制备重组腺病毒[J].中国病理生理杂志，2002,18(11):1 451-1 454.  

　   [14]     Graham FL, Prevec L. Manipulation of adenovirus Vectors[M]. In: Murry EJ,ed. Gene transfer and expression protocols(Methods in Molecular Biology,Vol 7). Clifton, NJ: Humana Press,Inc,1991:109-128.    

　  [15]     汪浩川,刘秉文,傅明德.人动脉平滑肌细胞贴块培养法[J].华西医科大学学报, 1995,26(1):105-108.  

　   [16]     王家宁,胡大一,高天祥,等.pLXSN/LacZ逆转录病毒载体的构建及其在大鼠主动脉平滑肌细胞中的表达[J].中国心血管杂志, 1998,3(4):236-239