大鼠同种异体异位节段小肠移植模型
来源：岁月联盟
时间：2010-07-12
小肠移植是终末期肠功能衰竭，如短肠综合征的唯一确切方法［1］，但由于小肠富含淋巴组织，具有很高的免疫源性，是诸多器官移植中排斥反应发生率最高和最重的器官［2］，使小肠移植成为最具挑战性的腹腔脏器移植。20世纪80年代前，无论是在实验室还是在临床，小肠移植都远远落后于肝、肾等其它脏器的移植，直到20世纪80年代后期随着环孢素Ａ(CsA)的问世，小肠移植才开始有了根本性的突破。近年来虽然有强有力的非特异性免疫抑制剂的应用，但小肠移植排斥反应仍高达50%以上［3］，与其它脏器（肾、肝、心脏）相比，临床小肠移植仍处于起步阶段。目前困扰小肠移植的主要问题是排斥反应、多源性感染、缺血再灌注损伤和移植肠功能障碍等,因此建立可靠的动物模型进行实验研究极其重要。大鼠作为小肠移植模型实验动物有显著的优点,如购买和饲养的花费低、免疫学的构成更可控和对感染相对强的抵抗力等［4］。因此，在小肠移植研究领域最为常用。本实验建立一种并发症少、存活率高、稳定实用的大鼠小肠移植模型，为今后研究小肠移植排斥反应打下基础，现报道如下。
1 材料与方法
1.1 实验动物 选用健康成年SD大鼠100只，体重180～250 g(新疆医科大学实验动物中心提供)，分为供、受体各50只。手术前禁食12～15 h，饲以5％葡萄糖水喂养。10%水合氯醛((3 ml /kg)腹腔注射麻醉, 100 W白炽灯光照取暖。手术在显微镜下操作。
1.2 手术方法
1.2.1 供体手术 10%水合氯醛(3 ml/kg)腹腔注射麻醉,待大鼠麻醉完全后,术区备皮，仰卧位固定于显微镜下的木板上,酒精消毒腹部皮肤后, 尾静脉置管，缓慢推注肝素乳酸林格液2 ml（含肝素12.5 U）。十字切口开腹,盐水纱布保护肠管, 游离腹主动脉，在右肾动脉水平以下、左肾动脉水平上方结扎腹主动脉。分离解剖结肠系膜与小肠系膜间的粘连带，沿十二指肠找到屈氏韧带，距屈氏韧带约5 cm处选择分支较少、供应血管较粗的约15～20 cm的一段近端空肠，标记备用。游离结扎切断回结肠动静脉、右结肠动静脉、中结肠动静脉,同时游离横结肠和升结肠。翻开横结肠及升结肠，显露肠系膜上动脉及上静脉，结扎切断肠系膜上动脉及上静脉之间的结缔组织，显露肠系膜上动脉根部，并充分游离骨骼化。沿肠系膜上静脉找到门静脉，结扎切除其周围淋巴结和结缔组织，游离结扎切断十二指肠下动脉和十二指肠上、下静脉，将胰腺从门静脉上剥离下来。显露游离脾静脉，游离结扎肠系膜上静脉汇入门静脉分支至幽门静脉。游离腹腔动脉与左肾动脉之间的腹主动脉，结扎此段腹主动脉的所有腹腔动脉分支，保留肠系膜上动脉。于标记肠管远端同时结扎切断肠系膜上动静脉。于标记肠管两端切断，空肠断端缓慢而轻柔地注入4℃庆大霉素盐水行肠腔灌洗。在腹腔动脉水平阻断腹主动脉, 经右肾动脉插管至肠系膜上动脉水平,并以5-0丝线固定。结扎切断脾静脉，紧贴幽门静脉回流平面下方结扎切断门静脉，远心端开放。以含12.5 U/ml肝素的4℃乳酸林格液行小肠原位灌洗, 同时将大量冰屑敷于小肠上快速降温，低压灌洗肠系膜血管至肠管呈乳白色、门静脉断端流出液清亮为止。剪断肠系膜上动脉根部，将移植物放入4℃肝素乳酸林格液保存。热缺血时间约2～3 min。于腹腔动脉上方穿刺腹主动脉，取血约2～3 ml，肝素化保存备用。
1.2.2 受体手术 受体麻醉同供体，肌肉注射阿托品0.2 mg/kg,腹部正中切口，上至剑突,下至耻骨联合，用自制的腹部拉钩向两侧拉开腹壁，用乳酸林格液纱布保护切口周围的皮肤, 将肠管置于左侧腹外，以乳酸林格液纱布覆盖保护。盐水棉棒暴露游离肾血管水平以下腹主动脉及下腔静脉段约1～1.5 cm。5-0丝线于肾动脉水平下及髂血管水平上同时阻断下腔静脉和腹主动脉，依次阻断近心端和远心端。结扎腹主动脉及下腔静脉的所有分支,显微镊提起血管壁，于腹主动脉壁及下腔静脉壁各剪出一椭圆形缺口，直径应略大于供体肠系膜上动脉及门静脉直径，肝素乳酸林格液冲洗血管腔。乳酸林格液纱布包裹移植肠管并置于腹外, 生理盐水冰屑覆于纱布上以局部降温。11-0滑线端侧连续吻合腹主动脉－肠系膜上动脉、下腔静脉－肠系膜上静脉，吻合过程中吻合处浸于肝素乳酸林格液中。以棉球压迫动脉吻合口周围,依次松开远心端及近心端，恢复肠管血液循环。冷缺血（50±10）min，如血管吻合口通畅，移植小肠迅速红润并可见明显的小血管搏动，肠腔内分泌出乳白色肠液。吻合后可常规使用凝胶海绵压迫于吻合口处止血，若仍有少许出血，以棉球轻轻压迫即可，视出血量经尾静脉置管通路推注供体血约2～3 ml。8-0滑线将供体血管周围组织与受体固定，防止血管扭曲造成血栓形成及供体移植血管缺血坏死。双侧肠管造瘘于右侧腹壁，10ml温庆大霉素盐水冲洗腹腔，查无活动性出血后关腹。
2 结果
预试验10次，术后72 h存活4只（40%）。未能存活72 h以上有6只大鼠（60%），其死亡主要原因为失血性休克、吻合后血管狭窄、静脉吻合口部位血栓形成、腹腔内感染以及不明原因。技术成熟后进行正式实验40次，术后72h存活34只（85%）,未能存活72 h以上6只大鼠（15%）。正式实验时手术失败的6只大鼠主要死亡原因为静脉吻合口部位血栓形成2只，术后腹腔内出血2只，供体肠血管扭曲1只，不明原因1只。全部手术时间平均160 min,供体手术时间平均70 min，受体手术时间平均90 min。整个手术过程为一人操作，手术时间约3 h。
3 讨论
本研究显示，显微镜下大鼠同种异体异位节段性小肠移植模型的建立，可为小肠移植基础研究提供良好的动物模型。在手术操作中移植肠的获取、血管吻合技术是提高手术成功率的关键，而术中输血、补液、术后保温等围手术期处理是提高术后存活率的关键。
3.1 控制体重 本组SD大鼠控制体重在180～250 g，体重适宜，能承受较长的手术时间及麻醉时间，对血管阻断的耐受力较强，血管的脆性较小，弹性较好，钳夹时不易破裂出血。
3.2 术前禁食 禁食有利于肠道灌洗，而肠道灌洗是关系手术成功的一个重要因素。禁食后肠道不充盈，腹腔内容量减小，进行血管吻合时有利于操作空间的显露。禁食时间过短，达不到禁食效果，肠道内有残留粪便，易污染手术野，增加术中感染机率和手术失败率。禁食时间过长，导致大鼠免疫力降低，抵抗力下降，对手术及麻醉的耐受力下降，增加手术失败率。用代谢笼防止大鼠食粪及敷料，当禁食时间控制在12～15 h时，肠道基本排泄干净，再辅以5％葡萄糖水喂养，可维持大鼠基本营养需要量，短期内对其健康状况及抵抗力影响不大。
3.3 受体输血 封闭群大鼠间进行相互输血及交叉配血实验，结果证明血型符合并且不会出现输血反应［5］。手术过程中常难免会有出血，出血量多少不等将成为实验干扰因素，所以术后予大鼠适量输血是可行的，且能提高手术成功率。
3.4 术中保温及术后复温 预实验发现，术中和术后保温是影响动物模型成功建立的重要因素之一。故正式实验中使用100 W白炽灯光照取暖，控制温度在22℃左右，使大鼠能够更好地耐受手术，术后将大鼠饲养于20～24℃的恒温环境。
3.5 血管重建的方式 建议在行预试验前进行一段时间的显微外科培训。用供体的肠系膜上动脉、门静脉分别与受体的腹主动脉、下腔静脉进行端侧吻合［6］，如显微外科技术过关，这一吻合方式并不增加吻合时间，也不会增加吻合口血栓形成机率。本实验采用5-0丝线同时阻断下腔静脉和腹主动脉，这一阻断方式并不增加手术难度及并发症，可避免游离腹主动脉及下腔静脉时可能出现的出血等风险。吻合完毕后可常规使用凝胶海绵压迫于吻合口处止血，恢复血流后使用8-0滑线将供体血管周围组织与受体固定，防止血管扭曲造成血栓形成及供体移植血管缺血坏死。
